Установка Rigaku для рентгеновской кристаллографии белков
Геном живых организмов представляет собой полную «инструкцию по сборке» клеток и тканей. При этом информация о строении и функциях «рабочих», которые следуют данной инструкции, также записана в ней. Основными «рабочими», выполняющими многочисленные функции, в живых клетках являются молекулы белков. Всего у человека известно около 30 тысяч белок-кодирующих генов. Реальное разнообразие белков может быть значительно больше.
Что такое структурная биология
Белки представляют собой большие линейные полимеры, состоящие из аминокислот. Последовательность аминокислот белка закодирована в геноме (правила кодирования носят название генетического кода) и полностью определяет его трехмерную структуру и функцию.
Структурная биология занимается определением и исследованием трехмерных структур белков и других макромолекул. В биологии существует такая парадигма: структура определяет функцию. Это означает, что, зная трехмерную структуру белка, исследователи могут сделать предположения о назначении молекулы. Трехмерная структура белка, в свою очередь, однозначно определяется его аминокислотной последовательностью, закодированной в геноме. Это открывает перспективы для компьютерного моделирования трехмерной структуры белков на основе их последовательностей.
Однако существующие алгоритмы и доступные на данный момент вычислительные мощности способны правильно «свернуть» только небольшие пептиды — короткие цепочки аминокислот. Трехмерные структуры белков (состоящих из сотен или даже тысяч аминокислот) определяют экспериментально: например, методами рентгеновской кристаллографии или криоэлектронной микроскопии. В лабораториях Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ осуществляется плодотворное взаимодействие между генетиками и структурными биологами.
Андрей Рогачев, заместитель директора Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ:
«Все глобальные современные открытия возможно делать преимущественно с применением междисциплинарных подходов, и направление генетических исследований не является исключением. В процессе разработки новых продуктов и технологий в области генетики мы применяем, развиваем и сочетаем методы молекулярной биологии, биохимии, биофизики, компьютерного моделирования и структурной биологии. В лабораториях нашего Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний реализована совместная работа биологов и физиков, что позволяет проводить исследования на переднем крае науки. Это прекрасно демонстрирует ряд проектов центра, целью которых является разработка новых генетических технологий и последующее использование этих разработок в медицине, разработка новых типов лекарственных препаратов, внедрение в биоэкономике. Непосредственное выполнение студентами полноценных научных задач под руководством ведущих ученых позволяет нам создавать качественные условия для подготовки высококлассных специалистов в области биофизики, востребованных в России и за рубежом».
Помощь генетикам
Классическая генетика предполагает определение фенотипического признака, механизмов его наследования и генетической обусловленности. Выявив ген или группу генов, ответственных за признак, экспериментальными методами исследуют свойства белков, соответствующих этим генам. Важной информацией для понимания механизмов работы белка на этом этапе оказывается трехмерная структура молекулы.
Также при создании новых белков из известных составляющих, так называемых доменов, возникает множество вопросов. Какие фрагменты можно взять, чтобы они продолжили выполнять свои функции? Как их соединить? На сегодня на них можно ответить, исследуя аналогичные структуры в известных базах данных. Специально разработанные компьютерные приложения позволяют вращать, перемещать и проводить измерения и прочие манипуляции с трехмерными структурами белков с помощью «мыши» и нескольких клавиш. Выделив отдельные функциональные домены и соединив их подобранными линкерами, то есть связующими молекулами подходящей длины, исследователи получают синтетические белки с заданными свойствами.
В лаборатории молекулярной генетики центра разрабатывают генетические конструкции для синтеза белков, которые впоследствии будут использованы при решении целого ряда фундаментальных и практических задач, таких как определение трехмерных структур, функций и молекулярных механизмов работы белков, получение ферментов для медицины и пищевой промышленности, создание бактериальных биосенсорных систем.
Илья Манухов, заведующий лабораторией молекулярной генетики Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ:
«Каждый биолог мечтает открыть новый вид. Каждый генетик мечтает открыть новый ген. А студент-биофизик должен уметь клонировать ПЦР-продукт в E.coli, тогда он сможет научиться экспрессировать белок, а потом откроет новую белковую структуру, осуществив давнюю мечту структурного биолога. В Центре исследования молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ ученые всех этих дисциплин стремятся к своей мечте, стараясь на этом пути не забыть открыть что-то полезное для человечества, например, победить старение и рак».
Обратная генетика
По мере совершенствования методов секвенирования ДНК получила стимул к развитию метагеномика — направление, в котором изучается генетический материал, получаемый из биологических проб, содержащих ДНК самых разных организмов.
Накопление информации о генетических последовательностях привело к возникновению обратной генетики. Ее методы позволяют определять функции для неизвестных генов, иными словами — фенотип, за который ген отвечает. Для этого анализируют его распространенность среди организмов разных видов, а также экспериментально проверяют, как его мутантные формы или увеличенное количество влияют на жизнедеятельность организма (клетки).
Если все эти операции не привели к изменению фенотипа, то исследователи выделяют кодируемый геном белок, чтобы определить его структуру. Среди трехмерных структур белков с известными функциями, которые агрегированы в целые базы данных, есть шанс найти гомологичную структуру или, по крайней мере, похожий трехмерный мотив. Таким образом, по аналогии, можно составить предположение о функции белка и его роли в организме.
В лаборатории теоретических и компьютерных исследований биологических макромолекул и геномов центра исследователи проводят биоинформатический анализ метагеномов прокариот с целью поиска белков, которые могут стать важными инструментами в биотехнологии и медицине, а также осуществляют молекулярное моделирование функционирования больших белковых комплексов.
Генная инженерия для биолога
Структура тримера мембранного белка родопсина. Integral Membrane Proteins Can Be Crystallized Directly from Nanodiscs, Nikolaev et al., 2017, Cryst Growth Des 17
Молекулярная генетика, а точнее ее методический раздел — генетическая инженерия — представляет собой инструмент, используемый биологами различных дисциплин. Ряд генно-инженерных манипуляций, необходимых для клонирования генов, стал в настоящее время рутинным. Например, мутагенез является одним из основных методов исследования функции белков: внося изменения в геном можно смотреть, как они влияют на фенотип.
Зачастую биологи вынуждены вынуждены вслепую «ломать по одной детальке в белке и проверять, работает ли он», небольшими шагами расширяя границы известного, чтобы составить более полную картину функционирования живой системы. Издержки этого подхода хорошо описаны Юрием Лазебником в известной статье Can Biologist Fix a Radio?, где автор переносит методы молекулярной биологии на другую задачу: понять устройство радио, как неопознанного объекта, теми же способами. Этот мысленный эксперимент показывает, что зачастую метод внесения случайных поломок поначалу дает неполную картину, однако по мере накопления информации исследователям удается верно расставить акценты и описать целые подсистемы или молекулярные пути.
В лаборатории перспективных исследований мембранных белков центра занимаются получением трехмерных структур белков, погруженных в биологические мембраны. Для этого необходимо вносить дополнительные мутации, которые не меняют функции, но стабилизируют структуру белка. Так называемые «стабилизирующие мутации» предотвращают агрегацию белков и выпадение их в виде осадка.
Интересными представителями мембранных белков являются белки семейства родопсинов. Они способны переносить заряженные частицы, ионы, через мембрану, причем такой перенос осуществляется с использованием энергии света. Именно эта особенность сделала родопсины основным инструментом недавно возникшей отрасли науки — оптогенетики. В лаборатории перспективных исследований мембранных белков МФТИ ученые получают родопсины с прогнозируемыми свойствами. Главной задачей оптогенетики является управление передачей нервных импульсов с помощью света. Уже сейчас разрабатываются прототипы устройств и технологий для восстановления слуха и зрения с помощью методов оптогенетики.
Таким образом, в современной биологии генетика и структурные исследования идут рука об руку, дополняя и расширяя возможности друг друга. Используя различные подходы, обе дисциплины позволяют пролить свет на фундаментальные молекулярные механизмы функционирования живых организмов.
Владимир Чупин, заведующий лабораторией физики и химии липидов Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ:
Исследовать мембранные белки значительно сложнее, чем растворимые. Для правильного функционирования такие белки требуют наличия определенного липидного окружения, не говоря уже о том, что они попросту выпадают в осадок в водных растворах. Это затрудняет процесс очистки и кристаллизации белков. Для очистки мембранных белков требуется добавление детергентов. В лаборатории физики и химии липидов ведется работа по поиску новых детергентов, сурфактантов, липидов, которые обеспечивают возможность кристаллизации мембранных белков без потери их функциональной активности.
