Пандемия COVID-19 унесла большое количество жизней и нанесла серьезный ущерб во многих сферах деятельности человека. Эта катастрофа — настоящий вызов мировому научному сообществу. Медики, биологи, химики, специалисты в самых разных науках сосредоточили свои усилия на разработке противовирусных препаратов, создании вакцин и других средствах борьбы с пандемией. Выпускники и сотрудники МФТИ внесли и продолжают вносить значительный вклад в борьбу с общим врагом.
Пандемические хроники
31 декабря 2019 года власти Китая официально объявили о первых случаях заражения неизвестной инфекционной пневмонией. Уже через несколько дней было показано, что возбудитель относится к семейству коронавирусов. Меньше двух недель потребовалось на расшифровку генома данного вируса, который был опубликован и загружен в базу данных GenBank 10 января 2020 года. Начиная с этого момента ученые всего мира получили доступ к «книге генетических инструкций», имеющейся у нового патогена. Знание систематической принадлежности и сравнение последовательности генома нового коронавируса с геномами уже известных вирусов сразу дало исследователям большое количество новой информации.
Михаил Щелканов, выпускник МФТИ, заведующий лабораторией вирусологии ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН:
— После публикации генома нового вируса, для которого позже было утверждено название SARS-CoV-2, стало понятно, что он принадлежит к группе бетакоронавирусов. Зная общие особенности представителей данной таксономической группы, мы сразу же могли в общих чертах представить себе особенности физиологии SARS-CoV-2, а также предложить вполне конкретные практические рекомендации по защите от заражения и лечению заболевания. Так, например, знание о наличии у вируса липидной оболочки говорит о том, что против него будут эффективны все хорошо известные жирорастворяющие дезинфектанты.
20 января 2020 года китайскими исследователями была подтверждена возможность передачи SARS-CoV-2 от человека к человеку. Это открытие показало всю серьезность ситуации. Практически тогда же, 21 января 2020, был опубликован филогенетичекий анализ SARS-CoV-2 и методами моделирования предсказано его взаимодействие с рецептором ACE2. Последний находится на клетках дыхательного тракта, и вирус использует его для проникновения в клетку. Позже это было подтверждено экспериментально. В частности, к началу марта были получены трехмерные структуры белка вируса, взаимодействующего с рецептором ACE2. Примерно в то же время количество подтвержденных случаев COVID-19 по всему миру достигло 20 тысяч, и 11 марта Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила о начале пандемии.
Наличие в общем доступе генома вируса и актуальность его исследования для медицины и общества привели к стремительному накоплению научных данных. В середине августа 2020 года по запросу SARS-CoV-2 в поисковых системах можно было найти более 70 тысяч научных публикаций.
Кристаллы мембранного белка семейства родопсинов под микроскопом
Каков он
Внутри коронавируса SARS-CoV-2 содержится РНК, связанная с белками нуклеокапсида. Снаружи вирион покрыт липидной оболочкой. Ее вирус получает от клетки-хозяина, в которой происходит его размножение. У вируса SARS-CoV2 в мембране присутствуют три вида белков. Самый крупный из поверхностных белков вируса, S-белок (от англ. Spike) образует на поверхности вируса крупные «шипы». Именно этот белок ответственен за взаимодействие с рецептором ACE2 на плазматической мембране клетки-хозяина и последующее проникновение в клетку человека.
[columns size=»2/3″ last=»false»]После этого проникновения вирусная РНК запускает внутри клетки-хозяина «конвейер» по производству новых вирусных частиц. Клетка-хозяин имеет защитные системы, препятствующие копированию в ней чужеродной РНК и синтезу с нее белков. Вирус же применяет множество хитростей, чтобы эти системы обойти. Например, геном вируса состоит из длинной РНК, кодирующей около десятка белков. Эта РНК имеет в своем начале особый сигнал, с которого начинается синтез белков в клетках эукариот (организмов, клетки которых имеют ядро). Однако этот сигнал единственный, и это означает, что с данной РНК будет синтезироваться только один — первый — белок.[/columns]
[columns size=»1/3″ last=»true»]
Для справки
Современные технологии получения и исследования структур мембранных белков позволяют на уровне отдельных атомов и групп атомов проследить механизм функционирования белка.
[/columns]
Тем не менее вирусы отряда Nidovirales (к которым относится SARS-CoV-2) нашли блестящее решение проблемы с помощью комбинаторики. Каждый ген обладает способностью рекомбинировать таким образом, что образуется РНК, имеющая сигнал и начинающаяся с данного гена. Таким образом, если пронумеровать гены, то в результате такой рекомбинации в клетке будут присутствовать РНК-сигнал-1-2-3…, сигнал-2-3-4…, сигнал-3-4-5… и т. д. При этом с каждой РНК считывается для синтеза белка только один, первый ген. Так в итоге в клетке появятся все белки, необходимые для сборки новых вирусных частиц.
Вирус SARS-CoV-2 синтезирует всего около десятка видов белков, однако этого достаточно для осуществления всех процессов инфицирования клеток и размножения вируса. Любопытно, что по этой причине многие вирусные белки оказываются мультифункциональными — выполняют несколько, на первый взгляд, не связанных между собой функций.
Структурная биология вирусных белков
Исследования вирусных белков крайне важны для понимания процессов размножения вирусов, а также разработки противовирусных препаратов и будущих вакцин. Как в технике форма детали определяет ее роль в работе механизма, так и в биологии трехмерная форма макромолекул, в частности, белков неразрывно связана с их функцией. Структурная биология представляет собой раздел науки, посвященный получению и исследованию трехмерных структур биологически важных макромолекул. Структурные биологи используют современные биофизические методы для точного определения координат всех атомов в белке. Далее, используя вычислительные алгоритмы, строят трехмерную компьютерную модель исследуемой молекулы. На базе такой модели возможно проведение виртуального компьютерного скрининга огромных библиотек веществ — потенциальных модуляторов активности данного белка. Использование виртуального скрининга (in silico) позволяет из миллионов веществ отобрать около сотни кандидатов, наиболее хорошо взаимодействующих с исследуемым белком и подавляющих его активность. Эти вещества — потенциальные лекарства. Их далее тестируют в функциональных экспериментах in vitro и уже в реальном эксперименте исследуют их способность подавлять активность белка. Наиболее эффективно показавшие себя вещества-кандидаты далее с участием фармкомпаний проходят доклинические и, в случае успеха, клинические испытания.
Структура комплекса рецептор-связывающего домена (RBD) S-белка SARS-CoV2 и человеческого рецептора ACE2. Источник: Nature
Одной из главных сложностей применения данного подхода к белкам вирусов является большое количество времени, которое уходит на прохождение всех этапов, в то время как возникновение новых вирусов требует быстрого реагирования. Однако методы и оборудование постоянно совершенствуются, процесс получения новых структур становится все более автоматизированным и более быстрым.
«В случае SARS-CoV-2, когда потребовалось реагировать быстро, например, китайские исследователи прошли весь процесс от гена до получения трехмерной структуры вирусного белка буквально за неделю, — комментирует Валентин Борщевский, заместитель заведующего лабораторией перспективных исследований мембранных белков МФТИ. — Более того, до сих пор все мировые крупные научные установки по получению трехмерных структур белков дают зеленый свет проектам по SARS-CoV-2, выделяя время на исследование таких образцов вне очереди».
Вирус SARS-CoV-2 по структуре вириона относят к группе оболочечных вирусов. Такие вирусы имеют липидную мембрану, которую они «воруют» у клетки-хозяина. В этой мембране обычно находится несколько типов вирусных белков, необходимых в первую очередь для слияния вируса с клеткой-хозяином.
У SARS-CoV-2 три типа мембранных белков, один из которых является ионным каналом. «Наличие ионных каналов у вирусов — не редкость. Появился даже специальный термин – виропорины – вирусные белки, способные формировать ионные каналы», — объясняет Михаил Щелканов, заведующий лабораторией вирусологии ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН. «Виропорины имеются, например, у вируса иммунодефицита человека, у вирусов гриппа А и В, у коронавирусов. Ионные каналы, как правило, необходимы для изменения рН-среды либо внутри вириона как один из этапов высвобождения нуклеокапсида (как это происходит у вирусов гриппа А и В), либо внутри цистерн эндоплазматического ретикулума при сборке дочерних вирусных частиц (как это происходит у коронавирусов)».
В обоих случаях понимание особенностей работы виропоринов и механизма изменения рН среды внутри вириона крайне важно для разработки противовирусных препаратов. Исследователи проводят поиск веществ, способных блокировать вирусные ионные каналы. Это — потенциальные лекарства. Неспособность изменять рН внутри вириона должна привести к нарушению размножения вируса в организме и остановке развития инфекции.
Исследования в МФТИ
В лаборатории перспективных исследований мембранных белков МФТИ изучают различные ионные каналы. Накопленный опыт работы с похожими белками позволил быстро включиться в работу с ионным каналом SARS-CoV-2. Вначале ученые синтезировали этот белок в лабораторных условиях. Процесс начали с получения гена, который был заказан в январе, — сразу же, как только стала доступна последовательность генома вируса.
[columns size=»1/3″ last=»false»]
[/columns]
[columns size=»2/3″ last=»true»]Далее белок производили при помощи модифицированных методов генетической инженерии бактерий E. coli. После синтеза белка следовал не менее трудоeмкий этап очистки. В середине марта был получен очищенный образец белка, пригодный для получения из него кристаллов. [/columns]
Европейский рентгеновский лазер на свободных электронах (European XFEL), Германия. Источник: XFEL
Вырастить кристаллы ионного канала из SARS-CoV-2 было необходимо для получения его трeхмерной структуры. Кристаллы этого белка выращивали в специальных условиях, в так называемых липидных кубических фазах. Так называются трехмерные структуры, состоящие из липидных бислоев, которые образуют периодическую решетку. Такое окружение близко к биологической мембране и позволяет мембранному белку «чувствовать себя как дома». В то же время свободная диффузия мембранных белков внутри такой системы способствует образованию кристаллов. Исследователям хорошо известно, что получить кристаллы мембранных белков непросто.
Но ученым из МФТИ повезло: кристаллы ионного канала SARS-CoV-2 выросли. Теперь требуется провести эксперимент по получению трехмерной структуры белка на установке XFEL (X-ray Free Electron Laser). Такая установка представляет собой огромный (несколько километров в длину) линейный ускоритель электронов, при торможении которых возникает высокоинтенсивное рентгеновское излучение, аналогичное излучению лазера. Кристаллы ионного канала SARS-CoV-2 имеют небольшой размер, поэтому для решения структуры этого белка требуются измерения на установке XFEL. Таких установок существует всего несколько в мире. Авторы уже подали заявки на измерения на установках XFEL в Германии и Японии.
Валентин Борщевский, заместитель заведующего лабораторией перспективных исследований мембранных белков МФТИ:
— Работа с мембранными белками, по сравнению с водорастворимыми, является весьма трудоемкой. Имея большой опыт в данной области, мы чувствовали своим долгом заняться исследованием мембранных белков SARS-CoV-2. Практически сразу после того, как стал доступен геном вируса, мы наметили потенциально интересные для нас белки SARS-CoV-2. У нас ранее были проекты по родственным вирусным белкам, так что мы имели в руках весь инструментарий. Но кроме опыта и знаний, которые, безусловно, необходимы, в науке есть место и удаче. Наши сотрудники поставили эксперимент по выращиванию кристаллов белка из SARS-CoV-2 буквально в последний день перед закрытием лаборатории на карантин. А в первый день после карантина пришли и увидели выросшие кристаллы!
Разные подходы — единые цели
[columns size=»1/2″ last=»false»]Современные технологии получения и исследования структур мембранных белков позволяют на уровне отдельных атомов и групп атомов проследить механизм функционирования белка. Однако вирусологи советуют биофизикам быть осторожнее с тем «миром детерминизма», который возникает при получении трехмерной структуры белков и их более крупных ансамблей.[/columns]
[columns size=»1/2″ last=»true»]
[/columns]
Робот NT8 Formulatrix, раскапывающий образцы в плашки для кристаллизации
«В случае вирусов мы еще очень далеки от переноса тех моделей, которые у нас есть, на реальные вирусные популяции. Дело в том, что популяция вирусов, даже в одной клетке, — это всегда, так сказать, «облако вариантов», подвижная стохастическая система с нечёткими границами. Здесь возникает интересная аналогия с физикой: реальное функционирование вирусной популяции скорее напоминает стохастичность квантовой механики. Когда я учился в МФТИ, мне казалось, что вирусологу квантовая механика никогда не пригодится в работе. Как же я ошибался! — рассказывает Михаил Щелканов. — Уникальность биологического образования в МФТИ, на мой взгляд, как раз и заключается в том, что фундаментальные биологические концепции последовательно укладываются в базис ощущения мироздания через физические законы».
Действительно, структурные биологи обычно получают довольно ограниченный набор трехмерных структур для одного белка. Однако возникают новые технологии, а существующие методики совершенствуются. В частности, уже упоминавшиеся установки XFEL позволяют получить структурные данные о популяции довольно крупных частиц, например, вирионов. В дальнейшем планируется повысить разрешение таких установок для исследования молекулярных ансамблей.
