Флуоресцентные белки стали важным инструментом биологов, с помощью которого можно решать самые разные задачи. Арсенал светящихся молекул постоянно пополняется — как за счет родственников знаменитого зеленого флуоресцентного белка (GFP), так и белками других групп, например связывающими флавины. Несмотря на различную структуру, такие белковые молекулы обычно светятся тоже зеленым, что ограничивает их применение в эксперименте. Однако недавно ученые создали модификации флавинсвязывающего белка CagFbFP с измененными спектрами флуоресценции. В своей новой статье для журнала Protein Science ученые из Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ совместно с коллегами из Института спектроскопии РАН и МГУ описали молекулярные механизмы, за счет которых новые белки стали светиться иначе.
С началом применения светящихся белков в биологии произошла своеобразная «флуоресцентная революция», которая сильно расширила возможности ученых. Первый подобный белок обнаружили в природе — у медузы Aequorea victoria, которая синтезирует знаменитый GFP (green fluorescent protein). Под действием синего или ультрафиолетового света он светится зеленым. Внося в последовательность GFP мутации, ученые вскоре получили множество разноцветных флуоресцентных белков. На них основано большое количество методов, позволяющих изучать процессы в живых клетках и органеллах, не причиняя им вреда, возможность увеличить разрешение световой микроскопии и отслеживать взаимодействия молекул.
«Флуоресцентный арсенал» ученых все время пополняется — как за счет новых «родственников» GFP, так и производными других белков. Например, родопсинов, которым мы обязаны своим зрением, или белков, связывающих флавины — органические соединения с тремя кольцами, участники многих биохимических реакций. Недавно один из природных флавинсвязывающих белков — CagFbFP, выделенный из термофильной бактерии Chloroflexus aggregans, — стал основой для создания новых молекул с измененными спектрами. Проще говоря, ученые создали белки, очень похожие на родительский, которые при этом светятся другим цветом.
Оставалась выяснить, как именно мутации в них изменили флуоресценцию. На вопрос ответило исследование российских биофизиков. Они описали молекулярные и химические механизмы свечения двух мутантных белков. Первый обозначен как Q148V, что указывает на замену находящейся в позиции 148 аминокислоты глютамина (Q) на валин (V) в положении 148; второй (I52V A85Q) имеет две аминокислотные замены: валин вместо изолейцина и глютамин вместо аланина.
Ученые использовали ряд современных биофизический методов: спектроскопию с временным разрешением, спектроскопию низких температур, рентгеноструктурный анализ, а также квантово-механическое и молекулярно-механическое моделирование (QM/MM). Это позволило детально описать структуру комплексов из двух молекул — флавина и белка — и их динамические перестройки, которые происходят под действием света и низких температур. Оказалось, что эффекты мутаций в двух белках сильно отличаются.
«Мы показали, что “синий мутант” изменил свой цвет из-за того, что мутация удалила положительный заряд в окрестности лиганда (то есть флавина), который энергетически способствовал электронному переходу. Это явление, в ходе которого электронная плотность в молекуле перераспределяется и изменяет свою энергию. В то же время “красный мутант” устроен сложнее: до поглощения света мутация в нем не влияет на заряды в окружении лиганда, однако после поглощения света измененная аминокислота поворачивается к лиганду и делает излучение фотона меньшим по энергии (более красным) электронным переходом», — пояснил Андрей Николаев, сотрудник лаборатории структурного анализа и инжиниринга мембранных систем МФТИ.
Ученые также отметили, что все три изученных белка — CagFbFP и два его производных — при низких температурах начинают фосфоресцировать алым цветом. Они не ожидали увидеть свечение на основе другого физического принципа, но также смогли объяснить его механизмы.
«Понимание процессов, приводящих к изменению цвета белка, может помочь предсказать новые мутации, которые еще сильнее сместят спектры флуоресценции и поглощения», — подчеркнул Андрей Николаев.
Полученный результат имеет большую практическую значимость, ведь данные флуоресцентные белки могут стать новым инструментом исследователей.
Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (проекты 21-64-00018 и 19-72-10132P).
