Ген SCN4A кодирует главную субъединицу мышечного натриевого канала Nav1.4, а мутации в нем связаны с параличом и миотонией, вызывающей длительный спазм. Известно свыше тысячи мутаций гена, однако роль большинства в развитии патологии пока не ясна. Поэтому ученые из ИБХ РАН, МФТИ, Института педиатрии и детской хирургии им. Вельтищева и их коллеги использовали различные биофизические методики, чтобы охарактеризовать обнаруженные у заболевших варианты гена SCN4A. Результат работы опубликован в The FASEB Journal (журнале Федерации американских обществ экспериментальной биологии).
Известно множество генетических нервно-мышечных заболеваний, которые в той или иной степени нарушают способность двигаться. Их причина — мутации в генах, участвующих в работе мышц и передаче к ним нервного импульса. Для каждой из таких редких патологий характерны особые гены и мутации в них. Человек может их унаследовать от родителя либо приобрести новые, собственные и уникальные.
Например, миотония — это генетическое заболевание, которое вызывает непроизвольный спазм мышц после их произвольного сокращения. Пациент с трудом возвращает подвижность с помощью новых движений, а из-за постоянных «физических упражнений» его мускулы становятся гипертрофированными.
Миотония может развиться из-за мутаций в гене SCN4A, который кодирует альфа-субъединицу потенциал-зависимого натриевого канала четвертого типа Nav1.4. Это крупный белковый комплекс, который располагается в мембране и пропускает через нее ионы натрия, тем самым генерируя потенциал действия и обеспечивая возбудимость мышечной клетки. Помимо белка-продукта гена SCN4A, в состав комплекса входит бета-субъединица, регулирующая его активность. Канал относится к потенциал-зависимым, то есть открывается или закрывается в зависимости от величины электрического потенциала на мембране.
Известно более тысячи мутаций в гене SCN4A, причем для 80 % до сих пор не установлена связь с развитием болезни. Авторы новой статьи сосредоточились на двух мутациях, приводящих к аминокислотным заменам K1302Q (лизин в положении 1302 заменен на глутамин) и G1306E (глицин — на глутаминовую кислоту). Они затрагивают область петли, расположенной в цитоплазме клетки, — это подвижный участок белка между третьим и четвертым повторами. Именно эта петля отвечает за быструю инактивацию («выключение») канала и особенно часто подвержена мутациям у пациентов с миотонией. Ученые охарактеризовали такие изменения белка с помощью целого спектра методов — от компьютерного моделирования до экспериментов на ооцитах лягушки и анализа клинических данных.
Александр Василевский, заведующий лабораторией молекулярных инструментов для нейробиологии ИБХ РАН, доцент кафедры физико-химической биологии и биотехнологии МФТИ, рассказывает: «Мы объединили усилия врачей из Института Вельтищева и медико-генетического центра “Геномед”, которые рассмотрели случаи пациентов с мутациями в гене SCN4A, наших специалистов в области биоорганической химии и электрофизиологии и коллег из ИЭФБ РАН и Университета Макмастера, которые провели компьютерное моделирование. В результате нам удалось всесторонне описать молекулярный механизм возникновения патологии».
Чтобы изучить активность реальных каналов в мембране, биологи ввели мРНК гена SCN4A с мутациями в женские половые клетки (неоплодотворенные ооциты) гладкой шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Животное является популярным объектом эмбриологических исследований, а ооциты лягушки используют для изучения ионного транспорта и работы мембранных белков. В клетки также ввели мРНК гена регуляторной бета-субъединицы натриевого канала.
С помощью технологии двухэлектродной фиксации потенциала ученые замерили вольт-амперную характеристику и другие свойства каналов. Оказалось, что изменения последовательности белка сильно повлияли на его функцию: у каналов с мутациями была нарушена инактивация, они хуже «выключались», чем нормальные. Выходит, при тех же значениях потенциала большее число мутантных каналов активно, что и вызывает патологию у пациентов — непроизвольный спазм мышц.
Наконец, авторы разобрались со структурными основами наблюдаемых изменений активности каналов. Они использовали алгоритмы искусственного интеллекта AlphaFold2 для предсказания трехмерной структуры молекулы на основе ее аминокислотной последовательности. Затем применили моделирование на основе метода Монте-Карло и нашли конформации с наименьшей энергией (то есть самые вероятные) среди множества возможных. Это позволило выяснить, как именно мутации в гене SCN4A изменяют стабильность различных состояний канала. Полученные результаты подтвердили патогенность изученных мутаций, то есть их связь с нервно-мышечным заболеванием, и в будущем могут быть использованы в медицинской практике.
