Ученые из МФТИ и ФНКЦ ФХМ им. Ю. М. Лопухина ФМБА России разработали экономически доступные методики анализа, которые будут полезны для изучения новых антикоагулянтов. Необходимые для анализов реактивы и оборудование — отечественного производства. Результаты исследований опубликованы в журнале «Медицина экстремальных ситуаций».
Под антикоагулянтами понимают вещества, которые угнетают свертывание крови и препятствуют образованию тромбов. Антикоагулянты применяют в комплексной терапии заболеваний сердца, варикозном расширении вен и для профилактики послеоперационных осложнений.
Для контроля состояния пациента в ходе лечения используют различные методы диагностики, в том числе коагулограмму. Коагулограмма — это анализ, позволяющий оценить свертываемость крови по ряду показателей, включая активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ) и тромбиновое время (ТВ). Как следует из названий, все три величины показывают продолжительность протекания различных реакций в плазме крови, приводящих к превращению крови из жидкости в плотный сгусток — тромб.
Есть два пути активации свертывания крови: внутренний и внешний. Для запуска внутреннего пути все компоненты уже присутствуют в крови, поэтому достаточно поместить ее в пробирку и наблюдать за образованием студенистой массы. Работоспособность внешнего пути активации проверяют с помощью лабораторного теста на определение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), норма — от 24 до 36 с. Внешний путь свертывания, наоборот, активируется при повреждении тканей и проверяется путем установления протромбинового времени (ПВ), референсный диапазон которого составляет 12—18 с.
На общем этапе свертывания, независимом от пути активации, под действием фермента тромбина растворимый белок плазмы крови фибриноген превращается в нерастворимый белок фибрин. Оценка общего пути свертывания проводится посредством определения тромбинового времени (ТВ). У здоровых людей данный процесс занимает 14—20 с и отдаленно похож на ткачество. Молекулы фибриногена, имеющие форму стержня диаметром 5 и длиной 50 нм, при активации склеиваются в фибриновые нити, а те, в свою очередь, сплетаются в объемное волокно, которое, словно паутина, задерживает клетки крови: тромбоциты, лейкоциты и эритроциты. Так завершается формирование тромба.
Надо отметить, что из-за высокого риска тромбоза некоторым пациентам жизненно необходим постоянный прием антикоагулянтов. К сожалению, кроме основного фармакологического действия — лечебного или профилактического, антикоагулянты могут вызывать побочные, то есть нежелательные для организма эффекты: аллергические реакции, кровотечения, боли в животе и другие. Это обуславливает поиск новых, более эффективных и безопасных медикаментов.
В начале поиска ученые наблюдают проявление биологической активности субстанции и имеют лишь общие соображения о природе и механизме ее действия, препятствующем свертыванию крови. Для получения более детальных сведений необходимо сначала обнаружить действующее вещество, а затем выделить его в относительно чистом виде. Особенно остро данная проблема стоит при изучении сложных смесей природного происхождения. Прежде всего, это слюна кровососущих животных, экстракты, то есть вытяжки из растительного или животного сырья, а также секреты — это жидкости, выделяемые клетками организма и содержащие биологически активные вещества.
Для исследований необходимы простые, дешевые и эффективные методы биохимического анализа, показывающие влияние изучаемых субстанций на свертываемость крови. Ученые из МФТИ и ФНКЦ ФХМ им. Ю. М. Лопухина ФМБА России разработали экономически доступные методики такого анализа на основе массовых тестов, используемых во всех клинико-диагностических лабораториях.
«Мы разработали методику биохимического анализа веществ, проявляющих антикоагуляционные свойства, которая основана на клинических тестах, широко применяемых для оценки свертываемости крови у пациентов, — говорит Валентин Манувера, доцент кафедры молекулярной и трансляционной медицины МФТИ. — Подчеркиваю, что все, используемое для анализов — отечественного производства».
Методику ученые апробировали на трех разных антикоагулянтах: гепарине натрия, гирудине и цистеин-богатом антикоагулянте медицинской пиявки. Гепарин натрия применяют в медицине уже более 100 лет, получают его из легких крупного рогатого скота или слизистой оболочки тонкого кишечника свиней. Гирудин содержится в слюнных железах пиявок и некоторых змей, в данной работе использовался рекомбинантный гирудин, то есть полученный с помощью технологий генной инженерии. Цистеин-богатый антикоагулянт медицинской пиявки — это недавно обнаруженный белок, который показал очень высокие антикоагуляционные свойства.
Опыты показали: чем выше концентрация всех трех антикоагулянтов в плазме крови, тем дольше протекает начальный и конечный этап свертывания, соответственно, больше значения активированного частичного тромбопластинового (АЧТВ) и тромбинового времени (ТВ). При этом гепарин не оказывает влияния на внешний путь, то есть на второй этап свертывания, следовательно, и на протромбиновое время (ПВ) тоже (Рисунок).
Рисунок. Результаты измерений протромбинового времени (ПВ) в контрольном образце плазмы крови (пунктирная линия) и при добавлении цистеин-богатого антикоагулянта медицинской пиявки (а), гирудина (б) и гепарина натрия (в). Источник: журнал «Медицина экстремальных ситуаций».
«Важно, что разработанная методика позволяет обнаружить вещества-антикоагулянты в самых разных смесях и провести первичный анализ их влияния на свертывание крови», — добавляет Валентин Манувера.
Можно ожидать, что экономически доступные и импортонезависимые методики поиска и первичного анализа антикоагулянтов, разработанные учеными, будут способствовать развитию фармацевтической отрасли России.
Исследование выполнено за счет гранта РНФ № 23-25-00006.
