Научная группа Чжана Фэна, одного из лидеров развития систем редактирования генома, нашла у бактерий и вирусов новый геноредактор. Как и CRISPR/Cas, она использует РНК-направляющие, может работать в клетках человека — и, кажется, может справляться с этим лучше.
В 2012 году у бактерий была открыта система CRISPR/Cas9, которая редактирует ДНК. В бактериях она служит частью иммунной системы, разрезая чужеродные генетические элементы, которые проникают в клетку. Пять лет назад за демонстрацию возможностей CRISPR/Cas вручили Нобелевскую премию, а сегодня эту систему используют уже не только учёные, но и медики: в конце 2023 года ex vivo генная терапия серповидноклеточной анемии, использующая CRISPR/Cas9, получила одобрение регуляторов и вышла на рынок в Великобритании и США.
Белок Cas9 — это РНК-направляемая эндонуклеаза. Он цепляется к ДНК и разрезает её в определённом месте. А место это определяется короткой (длиной в десятки азотистых оснований) молекулой РНК, которая называется направляющей или гидовой.
Поиск других нуклеаз, направляемых РНК, продолжается, и за последние годы были открыты и другие геноредакторы такого типа — например, та же самая группа Чжана Фэна несколько лет назад показала, что РНК-направляющая система OMEGA в союзе с белками фанзорами (Fz) способна работать в клетках человека. А теперь они нашли целое новое семейство белков, направляемых РНК, у паразитических бактерий, вирусов и архей. Система получила название TIGR, что означает Tandem Interspaced Guide RNA, то есть «направляющая РНК, расположенная парно».
Поиск TIGR’a начался в базе данных белков, предсказанных алгоритмами машинного обучения AlphaFold. Исследователи искали при помощи программы DALI белки, в структуре которых есть фрагмент, форма которого как минимум наполовину схожа с формой RDB (RNA-binding domain, домен связывания с РНК) у Cas9 — то есть на ту часть, которой Cas9 белок прикрепляется ко своей направляющей РНК. Среди множества гомологов они нашли маленький белок транспозазу из транспозона IS110, RBD которой похож на RBD Cas9 (этот транспозон и геноредактор на его базе мы обсуждали в материале «В погоне за универсальным геноредактором»).
Затем учёные продолжили искать — уже белки с RBD, форма которого похожа на RBD транспозазы IS110. И добрались до семейства Nop, то есть ядрышковых протеинов. Эти белки работают в ядрышке, внутренней части ядра у эукариот, в которой происходит синтез рибосом. И когда добрались до этого сходства, выяснили, что между IS110 и доменом Nop есть связь не только «формальная», но и более глубокая, уже на уровне генетики. То есть сходство, которое они обнаружили, уже не случайное как, например, похожесть двух прохожих, которых вы встретили на улице мегаполиса (если они и правда случайные прохожие друг другу). Это уже сходство, за которым стоит родство между этими прохожими — и оно ближе, чем полагается случайным прохожим.
Источник: Guilhem Faure et al. / Science, 2025
Тогда учёные принялись искать домены, похожие на такие РНК-чувствительные ядрышковые белки, уже не по базам третичных структур белков, а в метагеномных базах бактерий и вирусов.
И нашли. У бактерий, вирусов и архей в геномах есть участки, целые массивы, которые кодируют домен Nop, а рядом с ними — участки, кодирующие РНК-направляющие, напоминающие библиотеки CRISPR. Как и в CRISPR, в них содержатся повторы и спейсеры, т.е. те самые участки, где закодированы направляющие РНК.
Их главное отличие от CRISPR в том, что направляющих РНК у них два. Каждый из них комплементарен своей цепи ДНК. А между этими фрагментами (спейсерами) находятся повторяющиеся участки.
Ещё одно отличие — TIGR не нужен PAM, (protospacer-adjacent motif). PAM это короткий фрагмент ДНК, смежный с целевым участком, на который наводится система CRISPR/Cas9. PAM необходим, без него белок Cas9 не будет садится на цель и совершать свою функцию «молекулярных ножниц». Видимо, TIGR нацеливается полагаясь только на целевые последовательности, безо всяких дополнительных условий.
Массивы TIGR несут и информацию о эндонуклеазах Tas (TIGR-associated protein). Учёные нашли три разновидности Tas, отличающихся структурой. Белки отличаются своей способностью нести по два спейсера, а кроме того умением выгибать целевую ДНК под углом 180° в процессе редактирования.
Генетические карты TIGR-систем (справа) и модели третичных структур связанных с ними белков Tas (слева). Источник: Guilhem Faure et al. / Science, 2025
Эксперименты с человеческими клетками в пробирке показали, что систему можно использовать для редактирования человеческой ДНК.
У TIGR/Tas есть преимущества перед CRISPR/Cas9. «Благодаря уникальной структуре направляющей РНК, в которой спейсер разделен две части, система TIGR, может быть потенциально точнее, чем CRISPR/Cas9 системы, — говорит Дмитрий Карпов, доцент кафедры молекулярной и клеточной биологии ФБМФ МФТИ. — А также может иметь значительно меньше нежелательных последствий, включая и серьезные хромосомные перестройки на мишенях. TIGR/Tas система создает двухцепочечные разрывы не с тупыми концами, которые привлекают высокомутагенную систему репарации ДНК через негомологичное соединение концов (NHEJ), а с липкими концами, которые привлекают высокоточную систему гомологичной репарации по образцу (HDR, в этом случае вместе с геноредактором в клетку также доставляются нужные «заплатки», на которые должна ориентироваться система репарации) или менее опасную мутагенную систему микрогомологичного соединения концов (MMEJ)».
Схематичное изображение правил «наведения» TIGR/Tas (сверху) и CRISPR/Cas (снизу). Зеленым и красным, соответственно, выделены направляющие РНК.
Источник: Guilhem Faure et al. / Science, 2025
Упомянутое отсутствие PAM — ещё один важный бонус. «Это крайне важно для использования этой системы в технологиях редактирования генома, потому что в ее случае потенциальной мишенью в геноме служит любой участок ДНК, ограничений нет! — объясняет Дмитрий Карпов. — Тогда как даже в случае системы CRISPR/Cas9 из Streptococcus pyogenes с её очень коротким PAM — фактически это две буквы GG [последовательность нуклеотидов гуанин-гуанин], — ограничения довольно сильные. Эта система часто не имеет мишеней в АТ-богатых участках [участках с большим количеством адениновых и тиминовых нуклеотидов], например, промоторных и терминаторных областях генов [это последовательности, начинающие и завершающие ген в ДНК]. Другой аспект отсутствия PAM — можно предположить, что будет отсутствовать связанная с этим неспецифичная токсичность белка Tas. Например, у Cas9 S. pyogenes эта токсичность есть из-за того, что он может связываться с GC-богатыми участками. Таким образом, из-за отсутствия необходимости связываться PAM, система TIGR-Tas может быть нацелена на почти любой участок генома целевого организма и низко токсична для него».
Поскольку система только что открыта, известно о ней не так много. Например, как именно происходит синтез направляющих и самих белков Tas? Учёные наблюдали систему либо в состоянии «чертежа», в виде участков генома, либо уже в готовом виде, работающую с молекулами целевой ДНК.
Источник: Guilhem Faure et al. / Science, 2025
Другой вопрос — эволюционная связь системы с другими похожими системами, использующими РНК для нацеливания. Пока учёные предполагают, что TIGR это предок ядрышковых белков. И какая функция у TIGR? И откуда она берёт новые спейсеры? Для ответов на эти вопросы нужны новые исследования.
