Ученые из Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН и МФТИ сделали открытие, изменяющее базовые представления об оптическом методе анализа — зондовой флуоресценции для определения поверхностной гидрофобности биомолекул. Они предложили совершенно иное толкование причин усиления свечения флуоресцентного индикатора при его связывании с белками и надмолекулярными структурами на их основе. Результаты работы опубликованы в журнале Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy.
Флуоресценция — это способность вещества поглощать свет на определенной длине волны и через некоторое время испускать его на большей длине волны. Например, хлорофилл — зеленый пигмент растений, участвующий в фотосинтезе, — при облучении ультрафиолетом начинает светиться красным цветом.
Очень часто интенсивность флуоресценции мала, по сравнению с интенсивностью вызывающего ее света. Для регистрации данного явления используют специальные оптические приборы, с помощью которых ученые получают важную информацию о строении и функционировании биологических систем.
Если вещество не флуоресцирует, а многие биомолекулы именно такие, применяют флуоресцентные зонды. Под флуоресцентным зондом понимают соединение, которое, находясь в определенной среде в свободном состоянии, имеет известные характеристики флуоресценции, но изменяет их в результате присоединения к объекту исследований либо вариации условий среды. По изменению флуоресцентных свойств зондов ученые судят о процессах, протекающих в изучаемой системе.
Следует подчеркнуть, что влияние параметров среды на флуоресценцию зондов изучено зачастую недостаточно. Это мотивировало ученых из ИБХФ РАН и МФТИ: Юрия Цаплева, Марию Семенову и Алексея Трофимова — исследовать свойства 1-анилинонафталин-8-сульфоната (1,8-АНС) в различных средах. Выбор 1,8-АНС обусловлен широким его применением в биохимии, биофизике и молекулярной биологии.
Известно, что флуоресценция 1,8-АНС усиливается при связывании с гидрофобными, то есть не взаимодействующими с водой, участками биомолекул. Поэтому 1,8-АНС традиционно считался гидрофобным индикатором. К немалому удивлению ученых оказалось, что исследование флуоресценции 1,8-АНС в полярных гидрофильных средах ранее не проводилось. Полярными называют молекулы, обладающие электрическим дипольным моментом. Иными словами, атомы, образующие полярные молекулы, имеют разноименный электрический заряд благодаря сдвигу электронной плотности к более электроотрицательному атому.
Авторы описываемого исследования, напротив, стали экспериментировать с такими полярными жидкостями как диметилсульфоксид, глицерин и полиэтиленгликоль с молекулярной массой 380─440 г/моль. Полученные ими данные оказались весьма любопытны. Обнаружено усиление флуоресценции 1,8-АНС во всех трех указанных средах, причем до значений, свойственных комплексам 1,8-АНС с глобулярными белками.
В частности, интенсивность флуоресценции комплекса 1,8-АНС с бычьим сывороточным альбумином (БСА) — белком крови коров — линейно возрастает с увеличением количества 1,8-АНС, но до тех пор, пока соотношение концентраций зонда и биомолекулы меньше единицы. Квантовый выход данной системы, наоборот, снижается с увеличением концентрации 1,8-АНС (Рисунок 1). Надо подчеркнуть, что для другой системы — 1,8-АНС в полиэтиленгликоле — характеристики флуоресценции идентичны. Исключением стала только анизотропия флуоресценции, под которой понимают отличия в интенсивности свечения в зависимости от направления внутри среды.
Рисунок 1. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации 1,8-АНС (кривые 1 и 2) и квантового выхода флуоресценции от соотношения концентраций 1,8-АНС и БСА (кривая 3). Концентрация БСА составляет 2,9 µМ (закрашенные точки) и 5,8 µМ (светлые точки). Источник: Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy.
«Результаты нашей работы перевернули прежние представления о популярном инструменте измерения гидрофобности белков и тонких надмолекулярных конструкций для селективной доставки биоактивных соединений в организм», — сообщил Алексей Трофимов, заместитель директора по науке ИБХФ РАН, доцент департамента молекулярной и биологической физики МФТИ.
Ученые также обнаружили, что квантовый выход флуоресценции 1,8-АНС в воде минимальный, а спектральные линии смещены в красную область.
В смеси диметилсульфоксид — вода интенсивность флуоресценции 1,8-АНС изменяется интересным образом. При малых концентрациях воды ослабление флуоресценции меньше ожидаемого (Рисунок 2). С другой стороны, при малых концентрациях диметилсульфоксида уже не ослабление, а усиление флуоресценции 1,8-АНС значительно отстает от ожидаемого для случая аддитивного влияния компонентов смеси. Аддитивными называют величины, численное значение которых для всей системы может быть получено сложением значений, характеризующих отдельные ее части. Более того, для второго случая интенсивность флуоресценции пропорциональна квадрату мольной доли диметилсульфоксида.
Из вышесказанного очевидно, что вода тушит флуоресценцию 1,8-АНС. Это навело ученых на мысль, что для испускания кванта света возбужденной молекуле 1,8-АНС критически важно иметь рядом две молекулы диметилсульфоксида или, что эквивалентно, не иметь в данном объеме ни одной молекулы воды.
Рисунок 2. Зависимость интенсивности (кривая 1 и пунктирная линия) и длины волны максимума флуоресценции (кривая 2) 1,8-АНС от мольной доли диметилсульфоксида. Кривая 1 получена опытным путем. Пунктирная линия характеризует модельную смесь с аддитивным влиянием компонентов. Источник: Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy.
«Обнаруженное тушение флуоресценции 1-анилинонафталин-8-сульфоната молекулами воды побудило нас придать иронический характер графической аннотации к статье, где данное соединение показано под воображаемым зонтиком, — пояснил Алексей Трофимов. — На практике функцию зонтика выполняют усилители флуоресценции: как молекулы уже упомянутого диметилсульфоксида, так и другие, например, молекулы аммониевых соединений».
Рисунок 3. Графическая аннотация. Источник: Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy.
Ученые ставили опыты с четвертичными аммониевыми соединениями: хлоридом бензалкония, мирамистином, бромидом цетримония. Установлено, что флуоресценция усиливается в их присутствии за счет блокировки доступа молекул воды к критически важной для свечения области около возбужденной молекулы 1,8-АНС.
Можно заключить, что результаты исследований позволят повысить точность и достоверность интерпретации данных, полученных в ходе флуоресцентного анализа с помощью 1,8-АНС. Сделанное учеными открытие внесет существенный вклад в развитие методов оптической спектроскопии и разработку чувствительных флуоресцентных зондов.
