Коллектив российских ученых в экспедиционных условиях провел испытания lux-биосенсоров. С их использованием был исследован грунт и ткани донных обитателей северных морей: Баренцева, Карского и Лаптевых. Результаты работы опубликованы в журнале Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology и будут полезны для изучения закономерностей аккумуляции токсичных веществ в донных отложениях.
Донные отложения представляют собой рыхлый органоминеральный слой на дне водоема. В их состав входят обломки горных пород, останки обитателей водной среды и осадки, выпавшие вследствие химических реакций, инициированных природными явлениями либо деятельностью человека. Донные отложения — своего рода хранилище, по содержимому которого можно судить о текущих изменениях состояния водоема и вероятных в будущем. Результаты анализов донных отложений на токсичные соединения являются важными прогностическими показателями.
Для изучения грунта северных морей: Баренцева, Карского, Лаптевых — и населяющих его организмов, то есть бентоса, сотрудники шести ведущих научных организаций России отправились в экспедицию. Ученые производили пробоотбор на глубине от 35 до 300 м с помощью дночерпателя «Океан-0,25» объемом 100 л и площадью 0,25 м2, спуск и подъем которого осуществляли лебедкой. Полученные пробы состояли из обводненного ила с включениями песка и представителей бентоса. При обнаружении донных обитателей ученые отделяли их от других компонентов пробы путем промывания. Материал проб измельчали и центрифугировали. По результатам анализа супернатанта — жидкости, выделившейся над осадком, — ученые оценивали содержание вредных веществ в грунте и тканях членистоногих.
Для обнаружения токсикантов ученые использовали lux-биосенсоры. Составляющими биосенсора являются чувствительный элемент или биорецептор, преобразователь сигналов и микроэлектронный блок. В данной работе биорецепторами выступали модифицированные бактериальные клетки, которые испускали свечение в ответ на действие раздражителя либо токсиканта. Измерение интенсивности светового сигнала и его представление в цифровой форме осуществлялось высокочувствительным люминометром «Биотокс-7BM» отечественного производства.
Методами генной инженерии ученые интегрировали lux-гены в ДНК грамположительных и грамотрицательных бактерий: сенной палочки (лат. Bacillus subtilis) и кишечной палочки (лат. Escherichia coli) соответственно. Благодаря этому штаммы стали способными люминесцировать, то есть испускать кванты сине-зеленого света с длиной волны около 490 нм. Lux-гены сшиты с промоторами — участками молекулы ДНК, выполняющими функцию регуляторных элементов. Они отвечают за проявление lux-генов следующим образом: конкретное вещество или стрессовый фактор, действуя на бактериальные клетки, вызывает активацию промотора, что, в свою очередь, усиливает свечение клеток. Использование грамположительных и грамотрицательных бактерий комплексно оправдано, так как проницаемость их клеточных стенок разная, соответственно, влияние токсикантов на них тоже будет отличаться.
«Ранее никто не исследовал возможность обнаружения токсичных соединений в морских донных отложениях с помощью lux-биосенсоров, — сообщил Илья Манухов, заведующий лабораторией молекулярной генетики МФТИ. — Мы продемонстрировали их успешную применимость».
Ученые использовали биосенсоры, детектирующие окислительный стресс, автоиндукторы и повреждения ДНК, в том числе ее алкилирование. Следует пояснить, что под окислительным стрессом понимают разрушительное воздействие свободных радикалов на клетки. Алкилирующими называют соединения, которые вызывают введение в органические молекулы алкильной группы. Автоиндукторы — это сигнальные молекулы системы Quorum sensing, именуемой также «чувством кворума», благодаря которому бактерии могут общаться между собой.
За время экспедиции на четырех станциях был отобран морской грунт и проанализирована его жидкая фракция. В пробах обнаружены алкилирующие агенты (Рисунок 1). Необходимо подчеркнуть, что эти вещества обладают мутагенным и канцерогенным потенциалом, иными словами, могут вызывать у живых существ мутации и онкологические заболевания. В связи с этим обнаружение указанных соединений и оценка их накопления в водоемах — важный экологический показатель. Ученые установили, что самое высокое содержание алкилирующих веществ в грунте со станции № 5.
Рисунок 1. Коэффициент индукции люминесценции биосенсора на основе сенной палочки (лат. Bacillus subtilis) при взаимодействии с супернатантом донных отложений. Номера станций и их координаты (северная широта, восточная долгота): 5 (70,53959°, 58,22493°) 23 (73,35283°, 59,64791°); 29 (75,80513°, 69,9099°); 31 (76,0552°, 73,97658°). Источник: Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology.
«Мы заметили, что алкилирующая активность проб морского грунта связана с концентрацией азота, — пояснил Илья Манухов. — Однако для подтверждения найденной зависимости требуется больше опытных данных».
На других шести станциях научная группа изучала ткани морских обитателей в донных отложениях. Анализ показал, что в этих пробах, как и в супернатанте, тоже присутствуют алкилирующие вещества (Рисунок 2). В тканях морского таракана и морского паука, обнаруженных в пробах со станций № 107 и 113, соответственно, алкилирующий потенциал почти в два раза больше, чем у гаммарусов — ракообразных. Данный факт указывает на прямую зависимость между продолжительностью жизни донных членистоногих и их способностью аккумулировать токсичные соединения.
Рисунок 2. Коэффициент индукции люминесценции биосенсора на основе сенной палочки (лат. Bacillus subtilis) при взаимодействии с жидкой фракцией тканей донных беспозвоночных. Номера станций и их координаты (северная широта, восточная долгота): 3 (70,37155°, 58,01313°); 59 (79,92821°, 78,51835°); 64 (80,25011°, 83,99403°); 102 (77,36283°, 98,07886667°); 107 (70,62193°, 58,29235°); 113 (77,80872°, 107,5658833°). Источник: Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology.
Дальнейшая работа в этом направлении позволит ученым расширить сферу применения lux-биосенсоров в экологических исследованиях и при изучении токсических свойств впервые синтезированных соединений. В частности, в следующих экспедициях будут изучены закономерности накопления токсичных соединений в морских грунтах и организмах донных обитателей.
________________________________
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 22-14-00124.
