Для работы любой клетки необходимы АТФ, молекулы — хранилища энергии. Их создают АТФ-синтазы, особые ферменты, которые есть в том числе в хлоропластах растений. Ученые МФТИ выяснили, как солевой состав окружающего раствора влияет на активность и стабильность этого белка в хлоропластах шпината. Статья опубликована в журнале Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology.
Живую клетку можно сравнить с заводом или другим предприятием, которое без остановки работает. Синтезирует одни вещества, разрушает другие, отстраивает опорные конструкции и делится, создавая свои копии. Все это требует затрат энергии, и ее необходимо бесперебойно обеспечивать.
Задачу решают специальные ферменты, то есть белки с каталитическими функциями. Аденозинтрифосфатсинтазы (АТФ-синтазы), как легко догадаться по названию, заняты синтезом тех самых «молекул-батареек» АТФ. Это даже не отдельные белковые молекулы, а крупные комплексы из ряда белков — субъединиц. Собственные АТФ-синтазы есть у всех живых клеток. Конструкция этой молекулярной машины может несколько различаться, но принципы работы универсальны.
АТФ-синтаза состоит из двух крупных частей. Одна из них погружена в толщу мембраны и называется Fo, другая находится в растворе внутри клетки и обозначена как F1 («головка»). Основа цитоплазматической части F1, которая растворима в воде, — это гетерогексамер, то есть комплекс из шести разных белковых молекул (по три чередующиеся альфа- и бета-субъединицы). Именно здесь происходит образование новых молекул АТФ. Мембранная часть комплекса Fo между тем работает как ротор, то есть вращающийся компонент механизма. Она состоит из расположенных по кругу одинаковых субъединиц. Fo и F1 соединены между собой двумя стержнями: это гамма-субъединица в центре и b-/b’-субъединицы на краю комплекса.
Как работает это хитроумное устройство? Ионы водорода проходят через мембранную часть АТФ-синтазы по градиенту концентрации. То есть с той стороны мембраны, где их больше, туда, где их меньше. Поток ионов вращает «ротор», который при помощи центрального стержня приводит в движение «головку» АТФ-синтазы. В результате та катализирует синтез АТФ из аденозиндифосфата (АДФ) и остатка фосфорной кислоты.
Примечательно, что АТФ-синтаза может также работать как АТФаза. То есть осуществлять обратный процесс — разрушать АТФ и извлекать из него энергию.
Ученые активно исследуют образование олигомеров АТФ-синтазы. То есть объединение таких молекулярных комплексов в еще более крупные, например димеры. Они описаны у митохондриальной АТФ-синтазы — она даже имеет особые субъединицы для такой сборки. Фермент из бактерий и хлоропластов — органелл растений, ответственных за фотосинтез, — таких лишены. Тем не менее авторы нового исследования ранее показали, что хлоропластная АТФ-синтаза тоже образует димеры, напоминающие по форме букву I. Для этого требуется высокая концентрация хлорида натрия.
На сей раз биофизики из Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ заинтересовались, как состав окружающего раствора сказывается на состоянии АТФ-синтазы и ее функциях. Они экстрагировали фермент из хлоропластов шпината и перенесли на липосомы — пузырьки из липидов, которые служат моделью реальных биологических мембран. Липосомы с АТФ-синтазой помещали в растворы солей — хлорида натрия NaCl, нитрата натрия NaNO3 и сульфата натрия Na2SO4 при разной концентрации.
Чтобы оценить поведение АТФ-синтазы, авторы замеряли скорость ее работы по росту концентрации АТФ. В среднем каждый фермент производил 0,04–0,07 молекулы АТФ за секунду, что примерно соответствует 20 секундам его «работы» для создания одного АТФ. Это намного меньшая скорость, чем была показана в предыдущих исследованиях АТФ-синтаз. Ученые объясняют разницу разрушением ферментов, потерей их активности по иным причинам и расхождениями в протоколах экспериментов.
Перенесенную на липосомы АТФ-синтазу шпината изучали при помощи нано-дифференциальной сканирующей флуориметрии (NanoDSF, nano-differential scanning fluorimetry). Это биофизический метод, позволяющий оценить изменчивость формы белка (в том числе его денатурацию) на основе флуоресценции его собственных аминокислот, а именно триптофана и тирозина. Сильная сторона NanoDSF — не нужно использовать дополнительные флуоресцентные красители.
Оказалось, что ионная сила раствора — мера интенсивности электрического поля, создаваемого всеми ионами в растворе, — при высоких значениях (более 1 моль на литр) снижает активность АТФ-синтазы в два раза. При этом неважно, какие именно ионы создают такую ионную силу: эффект не зависел от используемой соли.
Температура плавления АТФ-синтазы — то есть ее денатурация, потеря фиксированной трехмерной формы — в растворах хлоридов натрия и калия с большими значениями ионной силы повысилась. А именно увеличилась с 60,5 градуса Цельсия примерно до 62 градусов.
«Одним из центральных вопросов в изучении белков остаются механизмы, регулирующие их активность. В нашем исследовании мы обнаружили, что ионная сила раствора способна влиять на работу хлоропластной АТФ-синтазы шпината. Мы предполагаем, что это может быть одним из способов, с помощью которого растение „выключает” АТФ-синтазу в ночное время (когда отсутствует свет). Тем не менее для окончательного подтверждения этого механизма требуются дальнейшие исследования», — поделился Степан Осипов, сотрудник лаборатории молекулярной клеточной биологии и оптогенетики МФТИ.
