Биофизики МФТИ с коллегами из Института биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН оптимизировали метод бесклеточного синтеза для получения ключевых фрагментов рецепторов инсулина — их трансмембранных доменов. Разработанный протокол позволяет получать эти белки в достаточном количестве и с чистотой, необходимой для изучения методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Расшифровка структуры и анализ динамики этих доменов важны для понимания механизмов работы рецепторов и помогут в разработке направленных терапевтических подходов при раке и диабете. Исследование выполнено при поддержке РНФ (грант № 23-74-00024) и опубликовано в журнале Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology.
Рецепторы инсулинового семейства (InsR, IGF1R, IRR) играют центральную роль в регуляции метаболизма глюкозы, роста и выживания клеток. Нарушение их работы напрямую связано с сахарным диабетом, онкологическими и нейродегенеративными заболеваниями. Несмотря на значительный прогресс в структурной биологии, ключевой элемент этих белков — трансмембранный домен, который передает сигнал от внешней части рецептора внутрь клетки — остается «белым пятном». Отсутствие детальных структурных данных о нем не позволяет понять, как именно активируется рецептор, и ограничивает возможности разработки лекарств, нацеленных на него.
Для структурных исследований необходимы большие количества стабильного и чистого белка. Однако получение трансмембранных доменов традиционными методами экспрессии затруднено из-за их гидрофобной природы и низкой растворимости. Для преодоления этих ограничений исследователи использовали бесклеточную (cell-free) систему экспрессии. В отличие от классических подходов, в этом случае синтез белка происходит вне живых клеток — в контролируемой реакционной смеси, содержащей ферментативный аппарат клетки и необходимые низкомолекулярные компоненты. Такая реакционная система, протекающая в пробирке, функционирует как автономная «фабрика» по синтезу белка.
Ученые собрали и оптимизировали генетические конструкции, кодирующие трансмембранные домены трех рецепторов инсулинового семейства InsR, IGF1R и IRR, и подобрали условия, при которых бесклеточный синтез работал наиболее эффективно. В результате удалось получать до ~1,5 мг изотопно-меченых белков на миллилитр реакционной смеси после очистки. Для мембранных белков, которые традиционно считаются одними из самых «капризных» объектов в биохимии, такие выходы являются высоким показателем и сопоставимы с лучшими результатами, ранее опубликованными для аналогичных систем.
Качество полученных белков проверили с помощью высокоразрешающей ЯМР-спектроскопии на одном из самых мощных приборов — 800-МГц спектрометре, работающем в магнитном поле силой 19,2 Тл, что в сотни тысяч раз превышает магнитное поле Земли. Анализ спектров показал, что все три трансмембранных домена сохраняют правильную спиральную форму в среде, имитирующей клеточную мембрану. Это означает, что белки не просто удалось синтезировать, но и получить в состоянии, полностью пригодном для изучения их структуры и динамики.
Рисунок. ЯМР-спектры трансмембранных доменов инсулиновых рецепторов в мембраноподобной среде. Показаны спектры доменов IGF1R, InsR и IRR, подтверждающие, что все три белка сохраняют правильную спиральную структуру в условиях, имитирующих клеточную мембрану. Источник: Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology
Аспирант МФТИ Ярослав Бершацкий, чьи эксперименты и анализ данных легли в основу работы, отметил: «Эта работа — лишь небольшой шаг, но без него невозможны дальнейшие исследования. Она открывает возможность детально изучить, как именно происходит передача сигнала через мембрану и какую роль мембрана и липидное окружение играют в структуре и динамике трансмембранных доменов рецепторов инсулинового семейства».
Результаты создают основу для будущих исследований механизма передачи сигнала через мембрану и могут быть использованы при разработке новых терапевтических подходов, включая пептидные модуляторы активности рецепторов инсулинового семейства.
Работа выполнена учеными из Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ и лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии Института биоорганической химии РАН.
Исследование поддержано грантом Российского научного фонда (№ 23-74-00024).
