В МФТИ появилась еще одна исследовательская группа, работающая в области живых систем. Возглавляемая Вадимом Черезовым лаборатория будет заниматься исследованием структуры белковых молекул: включая белки, играющие ключевую роль в развитии ряда заболеваний.
Полное название лаборатории, которой руководит выпускник МФТИ 1993 года и факультета физико-химической биологии Вадим Геннадьевич Черезов — «лаборатория структурной биологии рецепторов, сопряженных с G-белком». Пресс-службе МФТИ удалось узнать, что именно это значит, какие цели ставят перед собой исследователи и какими именно методами планируют их достигать.
Структура белка и зачем ее знать
Ключевой задачей лаборатории является получение трехмерных моделей белковых молекул. Причем в первую очередь речь идет о белках, которые задействованы в регуляции артериального давления, в развитии воспалительных процессов, а также в формировании алкогольной и наркотической зависимости: точные модели этих белков очень важны для медиков. Именно воздействуя на выбранные учеными белки различными лекарствами, можно лечить различные заболевания — однако без знаний об устройстве молекул белка подобрать хороший препарат против, к примеру, гипертонии, затруднительно.
(Пример белковой структуры — β2-адренорецептор. Он позволяет клеткам реагировать на адреналин и он же является мишенью для ряда лекарств против астмы)
Зная трехмерную структуру белка, ученые смогут еще до начала экспериментов с реальными веществами сказать то, какие именно химические соединения можно использовать в качестве лекарств. Если проводить аналогию с макроскопическими объектами, то белковую молекулу можно уподобить сложному механизму замка, а молекула лекарства будет ключом, который этот замок открывает. Имея на руках чертежи замка, можно не пытаться вслепую перебирать многие тысячи ключей, а сделать один, точно подходящий к замку.
(На этих трех картинках — один и тот же белок. Для разных целей ученые используют разные иллюстрации; слева показан только скелет молекулы, в центре нарисованы спирали и листы, а справа отображена доступная для химических реакций поверхность)
Как именно узнают структуру белка?
Получение информации об устройстве белков, впрочем, является крайне сложной задачей. Молекулы слишком малы для того, чтобы можно было осмотреть их при помощи электронного или ощупать при помощи иглы сканирующего туннельного микроскопа. Для того, чтобы узнать форму молекул, физики применяют рентгеноструктурный метод — направляют на белковый образец пучок рентгеновского излучения и затем анализируют дифракционную картину.
Дифракция излучения на кристаллической решетке приводит к тому, что излучение в определенных направлениях оказывается ярче, чем в других. По распределению интенсивности дифрагировавшего пучка можно восстановить кристаллическую структуру образца. Для тех, кто уже близок к диплому физика или получил его, добавим — дифракционная картина являет собой Фурье-образ плотности электронных облаков.
(Пример дифракционной картины при взаимодействии рентгеновского излучения с белковым кристаллом)
С использованием рентгеновских лучей ранее установили структуру ДНК в начале 1950-х годов, но для анализа интересующих группу Вадима Черезова белков оборудование полувековой давности не годится. Техника для рентгеноструктурного анализа за это время существенно шагнула вперед — катодные трубки сменили трубки с вращающимся анодом, синхротроны и рентгеновские лазеры. В новой лаборатории уже смонтирована установка на основе трубки с вращающимся анодом и налажены контакты как с синхротронными, так и с лазерными рентгеновскими центрами.
(пояснение: вращающий анод нужен для того, чтобы электронный луч бежал по поверхности электрода, не останавливаясь в одном месте и не прожигая его, таким образом можно добиться большей интенсивности излучения)
(Установка крупным планом. Оранжевые и красные индикаторы зажигаются при работе, а сама установка смонтирована за специальным стеклянным ограждением для защиты персонала от облучения)
Прогресс в области рентгеноструктурного анализа долгое время был связан с увеличением яркости источника (чем он интенсивнее, тем качественнее дифракционная картина), но после появления синхротронов двигаться дальше в этом направлении стало невозможно — образцы под действием облучения начали просто-напросто сгорать. Последнее слово техники — это импульсный рентгеновский лазер с длительностью импульса в несколько фемтосекунд, такое устройство работает сейчас в Стэнфордском университете, еще один лазер построен в Японии, а в 2018 может быть запущен комплекс XFEL в Германии.
(На снимке туннель, в котором будет смонтирован рентгеновский лазер XFEL. В его строительстве участвует и РФ — финансируя 25% проекта)
Энергия одного импульса фемтосекундного рентгеновского лазера достаточна для превращения кристаллика белка в плазму, однако дифрагировавшие фотоны успевают пройти через образец раньше, чем его структура будет нарушена, за время импульса атомы смещаются на считанные доли ангстрема. Потеря одного образца окупается тем, что взамен ученые получают качественную дифракционную картину и вдобавок у исследователей появляется возможность фиксировать короткоживущие промежуточные формы белковых молекул во время их взаимодействия как между собой, так и с молекулами лекарственных препаратов.
По словам Вадима Черезова, в обозримом будущем яркость рентгеновских лазеров может стать столь высокой, что можно будет обойтись без кристаллов белка, а просто наблюдать дифракционную картину от одной-единственной молекулы. Интенсивность дифракционной картины пропорциональна в идеальном случае квадрату (а в реальном случае показатель степени меньше двух, но больше единицы) числа молекул, так что даже кубик с ребром в 10 молекул на 4-6 порядков лучше, чем одна молекула. И именно в десятки или сотни тысяч раз еще предстоит увеличить яркость излучения для анализа структуры белков по отдельным молекулам.
(Белковый кристалл обычно можно разглядеть только под микроскопом)
Как превратить молекулярные машины в кристаллы?
Даже небольшие, около микрометра в поперечнике, белковые кристаллы получить далеко не столь же просто, как, скажем, кристаллы неорганических соединений. Интересующие исследователей белки — это не просто пассивные строительные блоки для клеток внутренней выстилки кровеносных сосудов. Эти белки правильнее уподобить молекулярным замкам, взаимодействующим с определенными веществами-ключами; если «ключ» входит в «замок», то его конфигурация меняется, рецептор переходит в активное состояние. А если белок выделить из клетки и очистить, то в нем будут как активированные, так и неактивированные молекулы вперемешку. Кристалл из такой смеси не растет: в большинстве случаев смесь молекул разной формы нельзя сложить в аккуратную упорядоченную структуру.
Чтобы получить белковые молекулы только в той конфигурации, которая нужна ученым, рецепторы сначала нужно заблокировать: это делается либо генноинженерными методами (создается мутантный белок), либо путем пришивания к «молекулярному замку» дополнительного белка, своего рода заклинивающего механизм клина. И это еще не все — даже выделив белки в нужной конфигурации, ученые не могут сразу перейти к выращиванию кристалла. Интересующие их молекулы встроены в мембраны клетки и потому рост кристалла происходит совсем не так, как в случае с перенасыщенным раствором неорганических солей.
Как поясняет Вадим Черезов, раньше мембраны разрушали при помощи детергента (фактически — моющего средства), но сейчас появилась альтернативная техника, основанная на использовании так называемой липидной кубической фазы. Это искусственные сферы из двойного липидного слоя, причем плотно уложенные в кубическую решетку и соединенные между собой перемычками. Множество таких микрошариков с перемычками между собой образуем своего рода губку с консистенцией геля; если в мембрану внедрить нужные белки — то при определенных условиях можно добиться роста сначала двумерного, а потом и объемного кристалла белка.
Под «определенными условиями» понимается достаточно высокая влажность (иначе гель начнет сохнуть), правильно подобранная температура и дополнительные реактивы, инициирующие реакцию кристаллизации. Подбирать параметры роста кристалла на сегодня приходится опытным путем и перед тем, как кристалл удается вырастить, приходится предпринимать множество неудачных попыток; чтобы ускорить процесс, в лаборатории установлен ряд специальных приборов. Смесь кубосом и белков, приготовленная перемешиванием в обыкновенном шприце, раскапывается автоматическим манипулятором по почти сотне отдельных лунок на стеклянной пластине и затем пластина отправляется в инкубатор.
(руководитель лаборатории Вадим Черезов держит в руках пластину для образцов. Синий куб — камера, куда поступает сколлимированный пучок излучения и в которой можно определить общую форму молекул белка. Детектор установлен слева от фотографа. Обратите внимание на защитное стеклянное ограждение, во время работы установки доступ на это место запрещен)
Особый сканер, оснащенный двумя поляризационными фильтрами, автоматически снимает пластину с образцами в проходящем свете. Кристаллы, если они есть, поворачивают плоскость поляризации и за счет этого проявляют себя на снимке. Далее на образец направляют ультрафиолетовое излучение и, если в нем есть белковый кристалл, возникает флуоресценция — сочетание такой проверки со съемкой через поляризатор позволяет уверенно находить интересующие ученых объектов и при этом не путать кристаллы со, скажем, осевшей из воздуха пылинкой или высохшей каплей. Еще один способ, которым пользуются в новой лаборатории тоже основан на оптических эффектах: молекулы белка могут поглотить два фотона с меньшей энергией и затем испустить один квант света с большей энергией, чем у одного из поглощенных. Наличие так называемого бифотонного поглощения тоже является надежным признаком появления белковых кристаллов.
«Наш робот наносит на стеклянную пластину капли объемом всего в несколько десятков нанолитров. Это очень маленький объем и за счет этого небольшой порции дорогостоящих реактивов хватает сразу на множество проб. А автоматизированный поиск кристаллов упрощает работу, нам не требуется вручную отсматривать огромное количество образцов», рассказал Вадим Черезов.
В ближайшие годы лаборатория намерена получить трехмерную модель нескольких белков: это эндотелиновый рецептор (эндотелий — внутренняя выстилка кровеносных сосудов; такие рецепторы регулируют работу сердца и сосудов), уротенсин (еще один рецептор, который управляет сердечно-сосудистой системой), лейкотриеновые рецепторы, задействованные в развитии воспалительных реакций и белки, за счет которых нервные клетки реагируют на гамма-аминомасляную кислоту. Все эти белки очень важны для медиков, а с точки зрения биохимии их объединяет принадлежность к так называемым рецепторам, сопряженным с G-белком. Исследователи планируют сотрудничать как с лабораторией Георга Бюльдта, так и с другими группами — например, некоторые потенциальные лекарства предполагается синтезировать с помощью лаборатории Валерия Фокина и там же будут подготовлены реактивы для ускорения роста белковых кристаллов.
Далее из этого текста вы узнаете уже не непосредственно о работе лаборатории, а о том, что такое G-белок, как клетка обрабатывает информацию.
G-белок и прочие молекулярные машины
Новая лаборатория возникла в том числе потому, что МФТИ решил развивать не только традиционное для него физическое направление, но и область life sciences, науки о живых системах. Сочетание самых разных методов не позволяет однозначно охарактеризовать эту сферу как «физику» (хотя рентгеноструктурный анализ — это именно физика) или «биохимию» (приготовление белковых кристаллов происходит в помещении с традиционным для биохимиков оборудованием). Новая междисциплинарная область предполагает знание физики, математики, информационных технологий и биологии с химией.
Биология сегодня это уже далеко не систематизация живого мира («мышь домашняя, Mus musculus, относится к грызунам, млекопитающие) вкупе с его описанием. Начиная с середины прошлого столетия биология работает на молекулярном уровне и экспериментов в ней гораздо больше, чем описаний. Наш рассказ о том, что же такое G-белки, мы начнем с перечня ряда наиболее расхожих — в том числе и среди состоявшихся физиков — заблуждений.
Первое расхожее заблуждение. Белок — не просто стройматериал или питательное вещество.
Белки, наряду с жирами и углеводами, часто рассматривают как питательные вещества или своего рода строительные материалы, из которых собираются живые клетки. Но это представление далеко от действительности. На самом деле белки представляют собой настоящие механизмы с подвижными частями, умеющие передвигаться с места на место или собирать-разбирать другие молекулы.
Одним из самых впечатляющих примеров может быть фермент АТФ-синтаза, настоящая молекулярная машина для сборки молекул АТФ, аденазинтрифосфата, универсального носителя энергии в клетке. АТФ-синтаза не только склеивает молекулы АТФ из двух других компонентов, но еще и вращается вокруг своей оси, причем энергия для этого берется из разности потенциалов на той мембране, в которую встроен фермент. Рекомендуем посмотреть ролик, который показывает работу АТФ-синтазы: после него считать белки пассивными структурами будет сложно.
Рецепторы — это тоже белковые машины, встроенные в клеточные мембраны. Они позволяют узнавать те или иные молекулы и за счет этого решать самые разные задачи. Например, именно рецепторы позволяют клеткам реагировать на гормоны или регулировать деление клеток в зависимости от их плотности. Когда организм растет и в нем формируются разные органы, рецепторы обеспечивают получение клетками нужной специализации — стволовые клетки, в зависимости от своего расположения становятся клетками кожи, костной ткани, кровеносных сосудов и так далее.
(Натриевый канал, вид сверху. Этот специальный белок обеспечивает поддержание в клетке заданного уровня ионов Na+)
При взаимодействии с другими молекулами рецепторы меняют форму, а некоторые могут еще и управлять переносом через мембрану разных веществ. Существуют также молекулярные каналы для пропускания внутрь/наружу определенных ионов и даже белковые насосы, способные перекачивать ионы против градиента концентрации. То есть, проще говоря, туда, откуда они стремятся перетечь в другое место. Еще белковые молекулы умеют избирательно активировать или, напротив, подавлять определенные гены, с их помощью наш геном избавляется от мутаций (абсолютное большинство ошибок в ДНК исправляется само!), а нейроны за счет белковых рецепторов обмениваются нервными импульсами.
Второе расхожее заблужение — клетка глупа.
Клетка, даже если рассматривать сравнительно простые на фоне нейронов головного мозга бактериальные клетки способна обучаться. Даже у простейших кишечных палочек за несколько сотен поколений вырабатывается последовательность реакций, позволяющих минимизировать воздействие желудочных ферментов при попадании внутрь пищеварительного тракта животных. Более сложные клетки амеб уже способны запоминать воздействие внешних раздражителей (для физиков подчеркнем: это открытие опубликовано в Physical Review Letters!) — у одной клетки может быть память.
К клеткам, которые живут внутри организма, требования не менее, а более жесткие. Клетки должны уметь регулировать свой рост в зависимости от числа соседей. Клетки должны реагировать на внешние воздействия, причем слаженно, обеспечивая синхронное сокращение мышцы или единовременный выброс ферментов в желудочно-кишечный тракт. Клетки иммунной системы должны уметь находить посторонние микроорганизмы и уничтожать их, особняком стоит задача ликвидации зараженных вирусами или бесконтрольно делящихся клеток своего же организма. Наконец, оплодотворенная яйцеклетка должна вырасти в цельное многоклеточное существо, счет клеток в котором идет уже на десятки триллионов.
Клетки имеют и «органы чувств» — рецепторы, и связанную с ними систему управления. Они способны узнавать множество химических веществ и реагировать на изменения их концентрации; даже передача нервного импульса происходит не за счет банального изменения электрического потенциала у мембраны, а за счет взаимодействия рецепторов в синаптической щели с молекулами нейромедиатора. Упомянутые в названии лаборатории Вадима Черезова G-белки — важнейший компонент внутриклеточной системы обработки информации, усилитель входящих сигналов.
Усилитель
Внешним сигналом для клетки может быть практически что угодно. Свет (для колбочек и палочек в сетчатке), механические колебания или давление, изменения кислотности, температуры или даже вектора магнитной индукции — существует множество различных рецепторов, способных реагировать на изменения той или иной физической величины.
Рецепторы — это молекулы белка. Каждый может быть либо в активном, либо в неактивном состоянии и когда рецептор переходит в активное состояние, он приобретает способность взаимодействовать с другими белками. Точнее, с одним белком, тем самым G-белком, молекулярной машиной из трех отдельных частей под кодовыми обозначениями α, β, γ.
G-белок также перемещается по клеточной мембране, будучи целиком погруженным в цитоплазму. Подойдя к активному рецептору он разделяется на две части — α и β+γ; каждая часть, или, как говорят биохимики, субъединица может активировать другие белки. Группа из бета и гаммы субъединиц способна открывать ионные каналы и инициировать поток ионов через мембрану, а альфа-субъединица активирует фермент, производящий молекулы циклического аденинмонофосфата, цАМФ. Один рецептор может поменять конфигурацию многих G-белков, а G-белки, в свою очередь, могут активировать множество ионных каналов и ферментов, отвечающих за синтез цАМФ. Молекулы же цАМФ сами влияют на другие внутриклеточные механизмы, наряду с изменением концентрации ионов.
(Структура G-белка. Разные субъединицы показаны разными цветами, сверху отмечена мембрана клетки. Шарик — молекула ГДФ, гуанозиндифосфата, она играет важную вспомогательную роль в изменениях конфигурации молекулы. Подробнее про работу G-белка можно посмотреть в видеоролике из Essential Cell Biology, 4th Edition Alberts, Bray, Hopkin, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, & Walter)
Для активации рецептора на мембране нужна всего одна молекула, а за счет G-белка, ионных каналов и синтеза цАМФ эта одна молекула превращается в сотни и тысячи молекул или ионов. В созданных руками человека электронных схемах сигналом является изменение напряжения, а в живой клетке сигнал — это изменение концентрации молекул. Сами молекулы выступают носителем информации так же, как электроны или дырки в полупроводниковой схеме обеспечивают передачу данных по цепи или хранение их в ячейке памяти. И также, как без понимания работы операционного усилителя нельзя понять устройство сложного электронного прибора, работу клетки нельзя понять (и нельзя в нее вмешаться) без детального знания её молекулярного усилителя.
Множественность путей
Работа ученых по составлению схемы взаимодействия разных биомолекул друг с другом затрудняется тем, что почти все значимые для клетки сигналы передаются далеко не единственным путем. Многие рецепторы могут быть активированы некой молекулой (лигандом, как говорят биохимики) при взаимодействии лиганда с определенным участком белка — но при этом возможно и так, что другой лиганд провзаимодействует с другой частью той же белковой молекулы и даст схожий эффект. Или за счет взаимодействия лиганда Б с рецептором изменится взаимодействие того же рецептора с лигандом А, пусть этот А и связывается с белком в другом месте.
Кроме G-белков в клетке есть и специальный белок аррестин: он механически закрывает собой нижнюю часть рецептора и за счет этого блокирует его взаимодействие с G-белками. Аррестин, как правило, блокирует передачу сигнала и подавляет активность молекулярного усилителя — но в определенных условиях, связавшись с некоторыми другими белками, он сам запускает внутриклеточные механизмы передачи сигнала!
Подобная множественность путей передачи информации и функций отдельных молекул ведет не только к увеличению толщины справочников по биологии. По этой же причине становится практически невозможно подобрать лекарства без побочных последствий и со стопроцентной эффективностью. Препарат либо не воздействует на все те белки, работу которых необходимо скорректировать, либо попутно вмешивается туда, куда вмешиваться не следовало. Даже если физиологи определили все вовлеченные в патологический процесс белки, фармакологам все равно приходится подбирать лекарства практически наугад — без полной информации о структуре молекул предсказать заранее форму правильного «ключа ко всем замкам» нельзя. Равно как нельзя и подобрать правильную «связку ключей» — комбинацию препаратов для точной корректировки работы организма.
