Оптогенетические технологии позволяют управлять клетками и процессами внутри них с помощью света. Метод основан на различных микробных родопсинах — белках, связанных с ретиналем в качестве кофактора и переносящих ионы через мембраны под действием света. В новом исследовании физтехи использовали белок из архей Arch3, чтобы повысить показатель кислотности среды внутри культивируемых раковых клеток. Это привело к ускоренному образованию активных форм кислорода и программируемой клеточной смерти (апоптозу). Результаты опубликованы в журнале «Биохимия».
Оптогенетические методы пополнили арсенал биологов сравнительно недавно, 20 лет назад, и быстро зарекомендовали себя как мощный и высокоточный инструмент для управления клетками. Учёные, как правило, работают с так называемыми возбудимыми клетками, то есть способными отвечать активными действиями на сигнал извне: нейронами, мышечными клетками, клетками желез. Подход также годится для изучения тонких физиологических процессов в невозбудимых клетках. Например, можно исследовать их органеллы и компартменты, отслеживая изменения различных параметров среды — таких, как кислотность (pH), который важен для нормального функционирования клетки и ее частей. Его смещение в сторону меньших (закисление) или больших значений (защелачивание) связано с многими патологическими изменениями при болезнях.
Также важен показатель кислотности внутри митохондрий. Эти «энергетические станции» клетки играют важную роль в ее жизни и смерти, производя активные формы кислорода (АФК). Они имеют важное регуляторное значение в небольших количествах, но их взрывообразное накопление для клетки летально. В норме матрикс митохондрий имеет слабощелочную реакцию (pH около 8), а ее изменения могут приводить к запуску программы программируемой клеточной гибели — апоптоза.
Отдельный важный вопрос, как кислотность внутри митохондрий влияет на генерацию АФК. Сейчас оба фактора активно изучают, поскольку они играют роль в развитии заболеваний сердца, диабета, нейродегенеративных процессов и рака.
Авторы настоящей работы, биофизики из Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ, отмечают, что в клетках млекопитающих защелачивание матрикса, генерация активных форм кислорода и передача сигнала с помощью ионов кальция тесно связаны. Причем в определенных условиях эти факторы — вместе и по отдельности — способствуют появлению пор в мембранах митохондрий и, как следствие, гибели всей клетки. Образование АФК в этом случае — ключевой этап на пути клетки к апоптозу.
Учёные работали с флуоресцентными сенсорами HyPer7 — молекулами, которые избирательно накапливаются внутри клеток и их митохондрий. Изменяя свои спектры флуоресценции, они сигнализировали о наличии в среде перекиси водорода H2O2. Это соединение — одна из активных форм кислорода, и оценка его концентрации позволяет понять общий уровень окислительного стресса, то есть дисбаланса между активными формами кислорода и борющимися с ними антиоксидантными системами. HyPer7 ярко светится после возбуждения на длине волны 405 нанометров (фиолетовый свет). Однако после взаимодействия с перекисью он переключается в состояние, когда его более эффективно возбуждает голубой свет с длиной волны 488 нанометров.
В эксперименте использовали протонный насос Arch3 — белок археи Halorubrum sodomense, который выкачивает катионы водорода из клетки во внешнюю среду, если подействовать на него светом определенной длины волны. В результате внутри клетки падает их концентрация, а показатель кислотности pH растет (pH это шкала от 0 до 14; pH = 7 нейтральная среда, pH < 7 — кислая, pH > 7 — щелочная). Иными словами, происходит защелачивание цитоплазмы, основной среды клетки.
Arch3 экспрессировали на цитоплазматической мембране HeLa — иммортализированных клеток карциномы человека, классическом модельном объекте клеточной биологии. В цитоплазме и внутри митохондрий они содержали молекулы-сенсоры HyPer7.
Авторы учли соотношение интенсивностей флуоресценции для возбуждения на двух длинах волн, чтобы избежать артефактов спектральных замеров, в том числе вызванных сдвигом pH, изменениями формы клеток, их перемещением, смещением оптического фокуса и так далее. Как и следовало ожидать, оптогенетическое защелачивание вызвало резкий рост содержания перекиси водорода — одной из важнейших АФК — как в цитоплазме клеток, так и внутри митохондрий.
При этом в митохондриальном матриксе pH менялся почти сразу после «включения» протонного насоса Arch3, а генерация АФК начиналась с запозданием. Это указывает, что в «щелочном апоптозе» клеток важную роль играет образование перекиси и подобных ей соединений, однако детали этой сложной взаимосвязи еще предстоит выяснить.
«Мы показали, что длительное оптогенетическое защелачивание цитозоля (раствора внутри клетки) приводит к генерации активных форм кислорода в клетке. Это может быть одним из механизмов, запускающих клеточную гибель при повышении рН цитозоля. Изучение взаимосвязи внутриклеточного рН и уровня АФК важно как для понимания фундаментальных основ клеточной физиологии, так и для осмысления нарушений, происходящих, например, при злокачественной трансформации клеток, при онкологических болезнях или при развитии нейродегенерации», — отметила Анастасия Власова, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной клеточной биологии и оптогенетики Центра исследования молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ.
