Ученые МФТИ предложили новый метод, который позволит оперативно и более детально оценить состояние сердечных тканей, в том числе и при транспортировке, с помощью маркера ишемических повреждений ткани NADH. Работа опубликована в журнале Biochemistry.
Новый подход к неинвазивному оптическому обнаружению гипоксии (пониженному содержанию кислорода), которая может наблюдаться, когда потребляемая энергия не соответствует затрачиваемой энергии при проведении электромеханической волны в сердце, разработали ученые лаборатории экспериментальной и клеточной медицины МФТИ с коллегами. Гипоксия может привести к гипертрофии левого желудочка, а из-за нее развиваются серьезные осложнения. Также метод подходит для оперативной оценки метаболизма и повреждений сердечных клеток в том числе и при трансплантации.
Метод заключается в регистрации повреждений с помощью естественной флуоресценции никотинамидадениндинуклеотида (NADH), который является формой хранения энергии и используется в митохондриях. Также это одно из первых обнаруженных эндогенных биологических веществ, проявляющих автофлуоресценцию в видимом свете (fNADH), которая сильно коррелирует с потреблением кислорода клетками.
Как работает наше сердце? Физиология сердца включает сложную координацию сигнальных путей клеток, которые регулируют каждое сокращение. Сама сердечная электрическая активность возникает из-за динамики ионных каналов. Энергия для этих процессов получается из молекул АТФ — хранилищ энергии, вырабатываемых в митохондриях. Все эти функции взаимосвязаны. При правильной координации этих процессов сердце способно выполнять свою основную физиологическую функцию: сокращаться, чтобы перекачивать кровь в сосудистую систему.
Но сама жизнедеятельность организма, стрессы и травмы приводят к патологическим процессам, в том числе аритмии, которую вызывают локальные неоднородности. Аритмия, в свою очередь, может приводить к дискоординации вплоть до фатальной фибрилляции желудочков. А сама сложность системы регуляции сократимости сердца может вызвать непредсказуемые побочные эффекты при фармакологическом вмешательстве. Это подчеркивает острую необходимость во всесторонних методологиях скрининга сердца на этапе тестирования лекарств.
Для решения этих и ряда сопутствующих проблем ученые МФТИ провели исследования и серию экспериментов, применив подход оптического картирования, позволяющего изучать сопряжение метаболизма, возбуждения и сокращения в сердечной ткани человека.
«Для оценки состояния сердечной ткани возможно использовать флуоресцентные молекулы NADH, которые находятся непосредственно в сердце. Это позволяет избежать добавления красителей. Естественная флюоресцентность NADH способна подсветить любой орган ближним ультрафиолетовым излучением. В ответ он будет светиться синим, и это излучение можно зафиксировать. В этой работе мы хотели проверить, насколько такая флюоресцентная метка может дать точную информацию о состоянии органа. Мы рассматриваем наш метод скорее как референсный — запасной источник информации к классическим красителям, которые показывают сердечную волну возбуждения»,— рассказал об исследовании Михаил Слотвицкий, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной и клеточной медицины МФТИ.
Ученые провели эксперимент, в ходе которого замерили, как изменялась динамика флуоресценции NADH под воздействием постоянного излучения. Эти данные использовались в качестве исходного источника информации о клеточном метаболизме. Для классификации обратимых и необратимых стадий ишемического повреждения сотрудники лаборатории использовали чувствительный краситель.
«Каких целей мы хотели достичь проводя эту работу? Их несколько, есть и сугубо прикладные — определение состояния тканей органов при транспортировке. К сожалению, медицина до сих пор испытывает серьезный недостаток информации о состоянии сердца, которое готовят к пересадке. Его жизнеспособность напрямую зависит от времени и условий транспортировки. Способность сердца к пересадке сохраняется около четырех часов. Если время на пределе, орган уже не используют вне зависимости от его состояния.
Сложности возникают непосредственно во время „пути”. В это время электрическую активность сердца выключают для экономии энергии. Для этого через орган прогоняют солевой раствор, затем добавляют специальные компоненты, которые и должны заблокировать электрическую активность. В итоге сердце перестает сокращаться, потому что сигнала к сокращению нет. Так сердце экономит энергию, но при этом мы совершенно не знаем, в каком оно состоянии и насколько хорошо будет сокращаться, когда мы его пустим заново. Более точная и оперативная оценка локальных повреждений позволит увеличить процент удачных трансплантаций»,— подчеркнул Михаил Слотвицкий.
Для исследования в лаборатории вырастили специальную ткань из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека — монослой сердечных клеток для экспериментальной модели.
«Искусственная ткань позволила нам использовать активные красители, которые нельзя тестировать на человеке. Это дало более точный результат, который был недоступен в клинике. В ходе эксперимента мы смотрели, как волна возбуждения распространяется по органу, потом брали раствор, в котором обычно перевозятся сердца, останавливали активность монослоя специальным раствором и держали четыре часа, которые разрешены для транспортировки. За это время мы наблюдали, как естественная флюоресценция сердечной ткани меняется»,— добавил Михаил Слотвицкий.
Пример контрольного потенциала действия для плюрипотентных стволовых клеток человека на 60-е сутки дифференцировки
Ученые обнаружили что через четыре часа очаги, которые после запуска ткани показали дисфункцию, имели отличающуюся динамику флуоресценции: стала выше скорость изменения сигнала при записи. Раньше небольшое падение сигнала во время записи было неизбежным артефактом, но в своем исследовании ученые обнаружили, что такое падение сигнала (фотообесцвечивание) не случайно и несет новую информацию о метаболизме. Это позволило не только изучить проблемные места при транспортировке сердца, но и доказало, что клетки NADH позволяют просмотреть локально проблемные зоны после его запуска.
«В лечебной практике сохранность сердца оценивают с помощью биохимического анализа раствора, который пропускают через сердечные клетки. Биохимия показывает необратимые повреждения клеток, когда из них выходят ионы калия и тропонин. Но проблема в том, что их видно, когда сердце уже точно необратимо повреждено. Этот анализ реагирует на довольно большое число необратимо поврежденных клеток.
Молекулы NADH начинают светиться раньше, что позволяет увидеть ишемию до того, как она привела орган к необратимым повреждениям. Таким образом мы расширяем критерии оценки и увеличиваем число пригодных к пересадке органов на исходе четырех часов, когда дорога практически каждая секунда»,— заключил Михаил Слотвицкий.
В итоге исследователи не только изучили модуляции физиологии сердца при гипоксии с помощью этой методики, но и удачно применили ее для тестирования кардиотоксичности, которая является второй по значимости причиной отмены лекарств во всем мире. Определили влияние кардиоплегических растворов «Нормакор» и «Кустодиол» на физиологию кардиомиоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Была выявлена необратимая потеря возбудимости через четыре часа гипоксии в условиях ишемии, что способствует более точному определению состояния органов для пересадки.
Научная статья: Slotvitsky, M. M., Romanova, S. A., Dabizha, M. O. et al. Registration of NADH Photobleaching for Metabolism—Excitation—Contraction Coupling Studies in Layers of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Biochem. Moscow Suppl. Ser. A 19, 227–233 (2025). https://doi.org/10.1134/S1990747825700187
