Международная команда ученых, включающая сотрудников Центра фотоники и двумерных материалов МФТИ, усовершенствовала метод фотоакустической микроскопии трехмерных органоидов. Чтобы лазерный луч мог проникнуть в весь объем образца и вызвать в нем звуковые колебания, исследователи предложили использовать мультифокальную металинзу — покрытие, состоящее из наностолбиков оксида титана. Свет, проходя через нее, разбивается на множество параллельных лучей, которые фокусируются сразу в 60 точках на разных расстояниях от линзы. Такой «кластерный» фокус позволил исследователям «увидеть» органоид человеческого мозга целиком и отследить, как в его глубинах с течением времени меняется концентрация нейромеланина — одного из маркеров развития болезни Паркинсона. Исследование опубликовано в журнале Science Advances.
Органоиды — «мини-версии» человеческих органов, выращенные из стволовых клеток, позволяют ученым моделировать процессы, которые происходят при заболеваниях или воздействии лекарства. По сравнению с клетками, растущими плоским слоем на дне чашки Петри, трехмерная структура дает клеткам расти и взаимодействовать в условиях, более близких к условиям живой ткани. Между клетками формируется внеклеточный матрикс — сложная сеть из полисахаридов и белков. Он не только заселяет каждую клетку в определенную квартиру, но и предоставляет системы жизнеобеспечения, от канализации до своеобразного интернета. Увы, при этом рассматривать в микроскоп трехмерные структуры сложнее, потому что расположенные дальше от объектива части объекта «выпадают» из фокуса.
Традиционный метод — нарезать органоид на тонкие ломтики, окрасить их, а затем обработать изображения — долгий, трудоемкий и, естественно, разрушает объект наблюдения. Недеструктивная альтернатива такому подходу — фотоакустическая микроскопия. На образец воздействуют кратковременным, но мощным лазерным лучом, и в тканях, которые деформируются под его действием, возникают ультразвуковые колебания. Темные фрагменты поглощают излучение эффективнее, чем светлые, поэтому их колебания сильнее. Регистрируя исходящие ультразвуковые волны, можно получить картину распределения темных и светлых участков образца, не повреждая при этом сам органоид. У метода, однако, есть другая проблема — глубины изображения: чтобы получить трехмерную картинку, необходимо послойное сканирование, которое занимает много времени. Можно исследовать весь объем образца за один заход, но для этого нужна сложная, дорогая и громоздкая оптическая система, с помощью которой лазерное излучение распределяется по всему объему образца.
Ученые из Центра фотоники и двумерных материалов МФТИ и Южной Кореи нашли способ заменить ее с помощью металинзы — массива (метаповерхности) вертикально ориентированных столбиков, размеры которых сопоставимы с длиной волны света. Эти цилиндрические столбики имеют фиксированную высоту, но разные диаметры и расположены с периодичностью, фиксированной размером элементарной ячейки каждого элемента массива. Приставка мета- в этом случае означает, что линза сделана на основе метаматериалов: композитов, которые, благодаря своей микроструктуре, проявляют свойства, не встречающиеся в природе. Например, они могут обладать отрицательным показателем преломления. Теоретическое обоснование существования таких материалов предложил советский ученый Виктор Веселаго еще в 1968 году, а в начале двухтысячных появились первые реальные образцы. В свою очередь, метаповерхности являются двумерными сверхтонкими эквивалентами метаматериала, обладающими уникальными свойствами для контроля над распространением света.
«Каждый элемент массива определенным образом меняет траекторию и фазу излучения, проходящего через металинзу,— прокомментировал Александр Барулин, ведущий научный сотрудник лаборатории контролируемых оптических наноструктур Центра фотоники и двумерных материалов МФТИ, — в результате получается луч, способный сфокусироваться в области шириной порядка 2 микрометров и “глубиной” до полумиллиметра. Это в 13,5 раза больше, чем глубина изображения системы из оптических линз, а значит, нам не нужно получать длинную последовательность изображений на разных глубинах биообъекта — всю информацию мы получим за один раз. Кроме того, металинза очень компактна, ведь ее толщина составляет менее микрометра. Это имеет значение, если мы, например, хотим рассматривать создание переносных оптических систем для проведения подобных анализов вне лаборатории».
Рисунок 1. Слева: схема эксперимента — лазерный луч, проходя через металинзу, вызывает акустические колебания в органоиде, получившийся сигнал регистрируется с помощью ультразвукового детектора. Справа: изображение поверхности металинзы, полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа. Источник: Science Advances
Чтобы создать металинзу, исследователи сперва рассчитали форму и расположение каждого столбика, а затем с помощью электронно-лучевой литографии выжгли в силиконе ряд углублений, получив таким образом форму для отливок. Потом форму заполнили полимерной смолой с частицами оксида титана и дождались застывания.
Далее готовую металинзу сравнили с системой из обычных и асферических линз. Фотоакустические изображения трехмерных объектов — наклонного углеродного волокна и фрагмента листа из углеродных волокон, полученные с помощью металинзы, отличались возможностью увидеть детали в более широком диапазоне сканирования.
Рисунок 2. Фотоакустические изображения отдельных углеродных волокон и фрагмента листа из углеродных волокон, расположенных под наклоном, полученные с использованием металинзы, асферической и сферической линзы. Источник: Science Advances
В этой работе ученые показали, что распределения нейромеланина в живых органоидах переднего и среднего человеческого мозга, рассчитанные по снимкам с использованием металинзы, соответветствуют полученным традиционно, с помощью гистологии.
Рисунок 3. Скопления нейромеланина в меланинсодержащих органоидах переднего и среднего мозга, обнаруженные методом фотоакустической микроскопии с использованием металинзы и с помощью гистологии. Источник: Science Advances
При этом за одно сканирование возможно получить объемное изображение нейромеланина в цельных органоидах. Более того, новый метод позволяет наблюдать изменения, происходящие в живых клетках, день за днем.
Рисунок 4. Характеристика содержания нейромеланина в органоидах переднего мозга. Наложенные изображения, полученные методами оптической и фотоакустической микроскопии на 150-й, 170-й и 216-й день жизни органоида, и график, отражающий изменения содержания нейромеланина. Источник: Science Advances
«Потенциал нашего метода не ограничивается исследованием органоидов мозга и детектированием нейромеланина,— заключил Александр Барулин,— можно “увидеть” и другие вещества или биообъекты, поглощающие на длинах волн лазерного излучения, причем эти длины можно менять в пределах диапазона видимого света, это не влияет на способность металинзы создавать удлиненный фокус. Таким образом, наши результаты открывают путь для создания быстрых и портативных систем для усовершенствованных диагностических инструментов и платформ скрининга эффективности лекарственных средств на основе фотоакустической микроскопии».
_______________________________
Центр фотоники и двумерных материалов МФТИ — это хаб инновационных исследований мирового уровня, где наука превращается в технологии и решения для бизнеса и общества. Центр основан в 2016 году и объединяет 10 лабораторий, ориентированных на опережающие исследования с применением в промышленности и высокотехнологичных отраслях, включая энергетику, нефтегазохимическую сферу, телекоммуникации, IT, медицину и другие индустрии.
