Коллектив исследователей МФТИ впервые представил детальный протокол электрофизиологической «инвентаризации» светочувствительных клеток в трехмерных органоидах сетчатки. Применяя метод patch-clamp исследователи смогли не только измерить электрические потенциалы и ионные токи нейронов, но и точно идентифицировать заданные клетки с помощью флуоресцентного окрашивания.
Эта работа открывает путь к надежному тестированию препаратов для лечения дегенеративных заболеваний сетчатки, а также приближает создание бионических имплантатов, способных «разговаривать» на языке живых фоторецепторов. Исследование опубликовано в издательстве Springer Nature Link как часть книги Retinal Gene Therapy: Methods and Protocols.
Сетчатка — это тонкий слой светочувствительных клеток, покрывающий изнутри дно глазного яблока. Именно она преобразует свет в нервные импульсы для формирования изображения. Сетчатка состоит из фоторецепторов: палочек и колбочек, которые работают как живые детекторы света, но их сигналы принципиально отличаются от привычных нервных импульсов. В отличие от большинства нейронов, в темноте они находятся в возбужденном состоянии и непрерывно выделяют нейромедиатор.
Свет же запускает каскад реакций, который закрывает ионные каналы — клетка «замолкает». Именно этот парадоксальный ответ породил миф о том, что фоторецепторы не способны генерировать классические потенциалы действия. Позже выяснилось, что при определенных условиях они все же могут выдавать спайки, блокируемые тетродотоксином, который действует как «пробка» для ионных каналов.
Тонкие процессы, запускающие работу сетчатки глаза человека, до сих пор крайне трудно изучать, а порой и невозможно. И здесь на помощь приходят органоиды — искусственно выращенные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток трехмерные органотипичные структуры.
«Органоиды активно применяются в медицинских исследованиях. В нашем случае их получают с помощью генетического перепрограммирования: клетки крови человека репрограммируют обратно в эмбриональное состояние и получают индуцированные стволовые клетки. Затем путем дифференцировки направляют их к переходу в клетки сетчатки глаза.
В итоге клетки проходят стадии развития, очень похожие на эмбриональные, и через полгода органоиды обзаводятся слоями, содержащими настоящие фоторецепторы с наружными сегментами — теми самыми палочками, которые захватывают свет. Это высокоточная копия дает нам максимальные возможности для тестирования лекарств, проверки промоторов, изучения химических процессов и так далее»,— рассказал о работе первый автор Алсаллум Алмакдад, руководитель группы генной терапии ретинопатии, научный сотрудник лаборатории геномной инженерии МФТИ.
Но как проверить, что эти искусственно созданные ткани действительно похожи на свои природные аналоги по составу и электрической «начинке»?
Получение органоидов занимает три ключевых этапа созревания: ранний (80–110 дней культивации), средний (130 дней) и поздний (150 дней и более). На каждом этапе должен появиться определенный вид клеток. Например, в ранней стадии в сетчатке образуются ганглионарные клетки, в средней стадии — фоторецепторы, а в поздней — биполярные клетки.
«Непосредственное отслеживание динамики появления определенных клеток дает нам понимание, что наши органоиды дифференцируются в верном направлении. В этом случае пользуются окрашиванием — иммунофлуоресцентностью, подсвечивая наличие определенных маркеров или генов. Но верный состав еще не все. Мы должны доказать идентичность нашего органоида и со стороны физиологии. И это самое сложное. В мире этим вопросом занимаются только несколько лабораторий. В России мы первые применили метод patch-clamp на органоидах, чтобы точно доказать, что полученные фоторецепторы действительно похожи на природные»,— добавил Алсаллум Алмакдад.
Patch-clamp — это электрофизиологический метод, позволяющий вживую подслушать разговоры ионов через мембрану, измерить потенциал движения ионов в клетке. Каждый канал фоторецепторов отвечает на конкретные ионы: калия, натрия, кальция и других. Измерение потенциала движения дает нам возможность проверить как наличие этих каналов, так и активность их работы.
На поздних стадиях созревания клетки обзаводятся структурой, напоминающей наружный сегмент, и начинают экспрессировать белки-маркеры, такие как рековерин и родопсин. Эти мельчайшие сферические образования расположены на внешней стороне органоида. Для их определения исследователи разработали многоступенчатую процедуру. Сначала органоид фиксировали в камере с помощью специальной сетки. Далее под микроскопом подводили стеклянный микроэлектрод. Клетку нащупывали, притягивая с помощью легкого отрицательного давления и затем аккуратно разрывали мембрану под электродом, получая электрический доступ к внутренней среде нейрона.
Что же удалось услышать? В режиме фиксации тока ученые подавали на клетку короткие деполяризующие импульсы силой 50, 100, 200 и 300 пикоампер. В большинстве случаев фоторецептороподобные клетки не демонстрировали классических спайков, но некоторые из них отвечали потенциалами действия — и это важное наблюдение, подтверждающее их нейтральную природу.
Более информативным оказался режим фиксации напряжения, где клетку удерживают на постоянном мембранном потенциале, ступенчато меняют напряжение, записывая возникающие ионные токи. Так ученые выявили гиперполяризационный-активируемый ток, который нарастал по мере созревания органоида и по своим характеристикам приближался к току, описанному для приматов. Кроме того, они построили кривые зависимости тока от напряжения, которые практически совпали с полученными на фоторецепторах млекопитающих.
«Раньше многие коллеги сталкивались с проблемой: органоид дает слабый или противоречивый электрофизиологический ответ, и нельзя быть уверенным, записали вы именно фоторецептор или соседнюю ганглиозную клетку. Наш подход выводит исследователей на новый уровень достоверности: мы можем не только сказать “эти клетки похожи на фоторецепторы”, но и показать их электрический паспорт.
Также в ходе экспериментов нам удалось зафиксировать развитие тока на разных этапах. У 80-дневных органоидов он еще очень слаб, к 130 дням становится отчетливым, а после 150 суток достигает значений, сравнимых с клетками взрослых приматов. Это вполне объективный критерий функционального созревания»,— заключил Алсаллум Алмакдад.
Электрофизиологическая характеристика дает количественную оценку того, восстанавливают ли новые молекулы функцию светочувствительных клеток. Кроме того, разработка бионических протезов сетчатки наталкивается на проблему интерфейса: искусственные электроды должны стимулировать ганглиозные клетки, но было бы идеально «говорить» напрямую с фоторецепторами, если они еще живы. Знание их вольт-амперных характеристик и порогов возбудимости позволяет создавать более эффективные и щадящие стимуляторы.
В ближайшей перспективе ученые планируют применить описанный протокол для анализа синаптической передачи между фоторецепторами и биполярными клетками — следующими нейронами в цепи сетчатки. Для этого потребуется одновременная запись от двух или трех клеток. Другое направление — использование метода пэтч-клемп в сочетании с оптогенетикой: ввести в органоид ген светочувствительного канала, активируемого определенным цветом, и измерить, как это меняет электрические ответы.
Научная статья: Alsalloum, A., Kolotova, D., Malyshev, A., Volchkov, P. (2026); Electrophysiological Characterization of Photoreceptor-like Cells in Retinal Organoids Using Whole-Cell Patch Clamp Method; In: Carvalho, L.S. (eds) Retinal Gene Therapy. Methods in Molecular Biology, vol 3023. Humana, New York, NY. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-0716-5198-8_8
