Коллектив исследователей Центра живых систем МФТИ разработал метод культивирования фрагментов сетчатки человека в лабораторных условиях. Это позволит тестировать эффективность вирусных векторов для генной терапии еще до начала дорогих испытаний на животных, применяя более быстрый и безопасный путь разработки методов лечения слепоты, вызванной дегенерацией фоторецепторов. Исследование опубликовано в издательстве Springer Nature Link как часть книги Retinal Gene Therapy: Methods and Protocols.
В основе многих современных подходов к лечению наследственных заболеваний сетчатки лежит оптогенетическая генная терапия: с помощью безвредного вируса в клетки сетчатки доставляются гены, которые кодируют светочувствительные белки. Эти белки, внедренные в оставшиеся нейроны, возвращают им способность реагировать на свет, частично компенсируя утраченные фоторецепторы.
Медицинская практика уже имеет положительные результаты. Например, клинические испытания терапии на основе вируса AAV для гена RPE65 (мутации которого приводят к врожденному амаврозу Лебера) показали улучшение зрительных функций у пациентов. Однако о полноценном использовании этого метода в медицинской практике пока говорить рано.
Главная проблема заключается в том, что доклиническая оценка новых вирусных векторов традиционно опирается на тестировании на животных моделях и клеточных культурах. Но результаты, полученные на мышах, крысах или даже приматах, зачастую плохо воспроизводятся в человеческом глазу. Различия в строении сетчатки, экспрессии рецепторов на поверхности клеток и в работе иммунной системы могут искажать картину. Как следствие, многообещающий вектор, показавший отличный тропизм (сродство к определенным типам клеток) у животных, в реальности может оказаться неэффективным или даже токсичным для человека. К тому же такие эксперименты требуют значительного времени, средств и поднимают этические вопросы.
«Наш подход, основанный на культивировании эксплантатов с донорской сетчатки, позволяет напрямую изучать взаимодействие вирусных векторов с тканью человека, сохраняя при этом сложную архитектуру и типы клеток. Но этот метод включает несколько сложных ключевых этапов»,— рассказал о работе первый автор Алсаллум Алмакдад, руководитель группы генной терапии ретинопатии, научный сотрудник лаборатории геномной инженерии МФТИ.
В течение шести часов после смерти донора необходимо извлечь сетчатку и отделить от пигментного эпителия и стекловидного тела. Затем с помощью специального круглого пробойника диаметром 5 или 8 мм из разных областей вырезать одинаковые фрагменты. Эти фрагменты помещают на мембранные вставки с порами 0,4 микрона в специальный питательный раствор. Важно отметить, что сетчатка не плавает в жидкости, а находится на границе раздела сред: питательные вещества поступают снизу через поры, доступ воздуха обеспечивается сверху. Так создаются условия, близкие к физиологическим, и ткань может оставаться жизнеспособной до двух недель.
«Выделяя сетчатку, а затем культивируя мы способны с помощью создания специальной среды максимально сохранить ее жизнеспособность. Что это нам дает?
Это позволяет проверить на конкретном органе новые ассоциированные вирусы или лентевирусы, или новые платформы, которые считаются хорошими кандидатами для генной терапии. Достаточно в первый или второй день после выделения прокапать этих кандидатов буквально на сетчатку и подождать 7–14 дней, пока они зайдут в конкретные клетки. Затем посмотреть образцы на гистологию или с помощью флюоресцентности определить, где находятся ваши вирусы, на какие клетки они в итоге нацелились. То есть это довольно экономный и эффективный метод скрининга новой терапии»,— прокомментировал Алсаллум Алмакдад.
Для определения местоположения вирусов через сутки после начала культивирования на поверхность каждого наносят вирусные частицы AAV, несущие гены-репортеры, например флуоресцентный белок. Если вирус успешно проникает в клетки и запускает экспрессию гена, под микроскопом можно увидеть свечение. На восьмой день после трансдукции, когда сигнал стабилизируется, исследователи проводят анализ. Один из вариантов — фиксация и криостатное резание на срезы толщиной 13 микрометров с последующей иммунофлуоресцентной окраской. Это позволяет буквально увидеть, какие именно типы клеток оказались затронуты вирусом.
Уникальность предложенного подхода заключается в том, что он впервые объединяет в системе удобство клеточных культур с морфологической и функциональной сложностью целого органа. В отличие от классических клеточных линий, эксплантат сохраняет все типы нейронов и глиальных клеток в их естественном взаимном расположении и внеклеточном матриксе.
В отличие от живых клеток, здесь можно проводить прямую визуализацию и манипуляции, не беспокоясь о влиянии кровотока, иммунного ответа. Важно и то, что авторы разработали методики отдельно для разных зон сетчатки: макулярной (центральной, отвечающей за остроту зрения) и периферической. Это имеет огромное значение, так как многие заболевания поражают избирательно, например макулярная дегенерация начинается именно с центральной зоны.
Более того, с помощью такой модели можно оптимизировать способ введения вируса: однократное нанесение на поверхность эксплантата имитирует субретинальную инъекцию, а добавление в среду — интравитреальную. Это дает возможность предсказать, как разные пути доставки повлияют на распределение вектора в клинике.
Метод имеет свои ограничения, но по сути, исследователи создали биологический «стенд» для испытаний вирусов, который значительно ближе к реальности, чем стандартные клеточные культуры. Это ускорит разработку терапии для таких заболеваний, как пигментный ретинит, болезнь Штаргардта и возрастная макулярная дегенерация, от которых страдают миллионы людей по всему миру.
Научная статья: Alsalloum A., Khubetsova M., Mityaeva O., Volchkov P. (2026). Culture of Human Retinal Explants as an Ex Vivo Model for Retinal Gene Therapy. In: Carvalho, L.S. (eds) Retinal Gene Therapy: Methods in Molecular Biology, vol 3023. — Humana, New York, NY.
DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-0716-5198-8_7
