Классификация методов генной терапии
Метод 1. CRISPR-Cas9
Работает с помощью:
- Cas9 — белок, который может связываться с ДНК;
- «Зубы» для раскусывания ДНК;
- Гидовая РНК: комплементарна целевому фрагменту ДНК;
- Мутантный фрагмент ДНК.
Процесс:
- Гидовая РНК связывается с целевым фрагментом ДНК;
- PAM — короткая последовательность, на которую садится Cas9;
- Cas9 раскусывает обе цепи ДНК;
- Происходит двуцепочечный разрыв.
Далее — развилка:
1 вариант
Клетка сама залечит разрыв, скорее всего, с ошибками:
- вставка
или
- удаление фрагмента.
Происходит сдвиг рамки считывания.
2 вариант
- Можно предоставить клетке донорную ДНК с нужным участком;
- Происходит вставка нужного фрагмента.
Особенности:
1 вариант CRISPR-Cas9
- Эффект: Разрушение мутантного гена;
- Что лечат: ATTR-амилоидоз; серповидноклеточная анемия; бета-талассемия;
- Недостатки: Риск крупных нежелательных перестроек.
2 вариант CRISPR-Cas9
- Эффект: Исправление мутантного гена или вставка нового;
- Что лечат: Тяжелый комбинированный иммунодефицит; хроническая гранулематозная болезнь;
- Недостатки: Плохо работает в организме; сложная доставка донорной ДНК.
Метод 2. Редактирование оснований
Работает с помощью:
- Деаминаза — фермент, отщепляющий аминогруппу;
- Cas9-никаза — преобразованный Cas9, который может делать только одноцепочечные разрезы ДНК;
- Гидовая РНК;
- «Неправильное» основание.
Процесс:
- Деаминаза превращает одно основание в другое;
- Cas9-никаза делает рядом одноцепочечный разрез ДНК;
- Белки клетки замечают разрез, зашивают его и заодно меняют основание на второй цепи;
- ДНК с исправленным основанием.
Особенности:
- Эффект: Замена одного нуклеотида в мутантном гене.
- Что лечат: Гетерозиготная семейная гиперхолестеринемия.
- Недостатки: Возможны только C-T и A-G замены; случайные замены соседних оснований.
Метод 3. Праймированное редактирование
Работает с помощью:
- Обратная транскриптаза;
- Cas9-никаза;
- Химерная гидовая РНК;
- Образец для нового фрагмента;
- Фрагмент, комплементарный целевой последовательности.
Процесс:
- Cas9-никаза делает одноцепочечный разрез ДНК;
- Обратная транскриптаза достраивает ДНК, включая новый фрагмент;
- ДНК со вставленным новым фрагментом.
Особенности:
- Эффект: Точная замена нескольких нуклеотидов;
- Что лечат: Хроническая гранулематозная болезнь;
- Недостатки: Сравнительно невысокая эффективность.
Метод 4. ADAR-редактирование РНК
Работает с помощью:
- Гидовая РНК: комплементарна фрагменту целевой мРНК;
- «Неправильное» основание мРНК.
Процесс:
- Гидовая РНК связывается с целевым фрагментом мРНК;
- Некомплементарное основание;
- Клеточный фермент ADAR садится на двуцепочечную РНК;
- ADAR преобразует основание;
- мРНК с исправленным основанием.
Особенности:
- Эффект: Замена одного нуклеотида в РНК для временного восстановления синтеза нормального белка;
- Что лечат: Наследственные метаболические заболевания печени;
- Недостатки: Временный эффект; возможны только C-T и A-G замены.
