Физтехи разработали инновационную систему управления экспрессией генов в бактериях, которая позволяет контролировать производство целевых белков на уровне каждой отдельной клетки. Создание клеточных популяций с заданным уровнем производства белка открывает новые перспективы в синтетической биологии и промышленной ферментации. В основе системы лежат гены холодолюбивой бактерии Aliivibrio logei. Также новая платформа решает одну из насущных проблем современной биотехнологии — клеточный эгоизм, когда в идентичных условиях какие-то бактерии активно производят нужный белок, а какие-то бездействуют. Статья опубликована в журнале Biotech. Исследование поддержано Министерством науки и высшего образования РФ и Российским научным фондом .
Современные биологи повсеместно используют бактерии в качестве фабрик для биопромышленного производства. Бактерии вырабатывают белки, нуклеиновые кислоты, органические соединения и малые молекулы. Но до сих пор это производство сталкивается с проблемами, которые ученые из лаборатории молекулярной генетики МФТИ решили исправить серией экспериментальных работ.
«Чтобы заставить бактерию синтезировать нужный белок, инженеры проводят генную модификацию: доставляют в клетки инструкции в виде молекул ДНК-векторов с встроенными в них генами, позволяющие регулировать процесс синтеза необходимых белков. Но зачастую разные задачи требуют применения разных ДНК-векторов (инструкций) и нет универсальной, подходящей для всех задач. В итоге чтобы получить требуемые результаты, необходимо перебирать варианты инструкций. Это трудоемкая процедура»,— рассказал Сергей Баженов, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики МФТИ.
При этом разные ДНК-векторы отличаются по возможности регуляции и фиксации количества целевого белка, а при попытке отрегулировать синтез нужного белка культура бактерий зачастую ведет себя не как единый организм, а как капризное общество индивидуумов. При добавлении индуктора (вещества, являющегося сигналом к началу синтеза) часть популяции включается в производство белка на полную мощность, а другая часть не вовлечена в процесс. В биотехнологическом производстве это означает снижение общей производительности, увеличение метаболической нагрузки на клетки и значительные сложности при масштабировании процессов. Ученые давно искали способ заставить бактерии работать согласованно, и ответ нашелся в море.
«Мы не первый год изучаем поведение клеток бактерий. Пару лет назад наш коллектив разработал генетическую конструкцию, которая обладала уникальными свойствами, позволяющими выращивать культуру клеток при 37°С, не запуская при этом синтез нужных нам белков. Это обеспечивало возможность культуре быстро расти, не расходуя ресурсы на преждевременную работу. В итоге мы максимально быстро расширяли производственную мощность, а затем понижали температуру до 22–24°С, и клетки начинали обмениваться друг с другом малыми молекулами аутоиндуктора — информацией о том, насколько их много, и при достижении кворума начинали дружно вырабатывать целевой белок.
Но бывают задачи, когда нужен не сам белок, а некий продукт, который этот белок производит. Тогда в какой-то момент нам необходимо остановить производство. Белок перестает синтезироваться и начинает уже сам производить другие вещества. Или, например, мы исследуем функцию этого белка и задаемся целью создать фиксированное количество белка в каждой клетке. Мы охладили нашу популяцию бактерий, они почувствовали, что их много, в ответ начался синтез белка, который мы в нужный момент остановили уже за счет повышения температуры снова до 37°. В итоге за счет одного нашего вектора мы могли выполнять целый ряд задач. При этом раньше мы эти возможности показывали на уровне целой популяции. В новой же работе мы опустились на уровень отдельных клеток»,— добавил Сергей Баженов.
Для этой цели разработчики использовали способность клеток бактерий общаться между собой, добавив в новую генетическую конструкцию гены морских холодолюбивых Aliivibrio logei, которые и обеспечили это общение. Оно происходит с помощью химических сигналов и называется кворум-сенсингом, или чувством кворума. Этот механизм позволяет бактериям координировать свои действия в зависимости от плотности популяции: когда клеток становится достаточно много, они синхронно включают гены биолюминесценции или формирование биопленок.
Ключевые игроки процесса у морских светящихся бактерий — белок-рецептор LuxR и синтетаза LuxI, которая производит сигнальные молекулы. Одна из таких молекул (3OxoC6-HSL) свободно диффундирует через мембрану, связывается с LuxR, и комплекс активирует экспрессию целевых генов. Именно эта способность к саморегуляции привлекла внимание исследователей. В отличие от традиционных систем, где индуктор закачивается в клетку активно, аутоиндуктор проникает пассивно, что теоретически должно обеспечивать более равномерное распределение сигнала.
«Новая генетическая конструкция позволила нам наблюдать, как происходит активация синтеза и его остановка на уровне каждой отдельной клетки. Наблюдения этих процессов на всей популяции давали нам картину «средней температуры по больнице», и мы не знали, достигается ли промежуточное содержание целевого белка за счет частичной вовлеченности бактерий в процесс синтеза или же за счет регуляции активности каждой клетки в популяции. Наша векторная система позволила не только запустить и остановить синтез, но еще и отрегулировать интенсивность процесса. При этом в новой работе мы показали, что запуск синтеза и регуляция его интенсивности происходят во всех клетках одинаково, то есть не происходит разделения культуры на “трудяг” и “лентяев”.
Представим эксперимент в трех пробирках. В контрольной мы не снижаем температуру и в итоге не получим белок, в другой снизим температуру и дадим бактериям расти и самостоятельно запустить синтез при достижении кворума, получив при этом предельное количество белка. А третья пробирка имеет переменный режим: мы ее ненадолго охлаждаем, искусственно запускаем синтез целевого белка, добавив индуктор, а потом останавливаем синтез, поднимая температуру вновь. И таким образом мы получаем любое промежуточное значение от полного отсутствия до максимального значения, варьируя условия культивирования: время и интенсивность индукции. И это промежуточное значение будет достигаться не за счет того, что часть клеток активировалась, а часть нет, а за счет того, что каждая клетка активировалась в меру того, как мы хотели»,— подчеркнул Сергей Баженов.
В итоге ключевым аспектом дизайна эксперимента стала проверка роли петли положительной обратной связи — будет ли влиять способность синтезировать молекулы индуктора клетками на синхронность и однородность синтеза целевого белка. Для эксперимента в качестве модели выступил быстросозревающий флуоресцентный белок sfGFP, позволяющий с помощью цитометра оценить его содержание в каждой отдельной клетке.
В течение 30 минут после охлаждения и начала индукции распределение флуоресценции было широким, и при максимальной концентрации аутоиндуктора наблюдалась легкая бимодальность, указывающая на то, что часть клеток еще не успела отреагировать на сигнал. Однако уже через три часа индукции картина кардинально изменилась. Распределения флуоресценции стали узкими, монотонными и четко разделенными для разных концентраций аутоиндуктора. Это означает, что промежуточные уровни экспрессии достигаются не за счет смеси активно работающих и молчащих клеток, а за счет равномерного изменения уровня продукции в каждой клетке популяции.
Сравнение двух вариантов плазмид показало, что наличие гена luxI не оказывает существенного влияния на однородность экспрессии при заданных условиях. Однако само присутствие синтетазы LuxI вызывает аутоиндукцию: в культурах наблюдался рост флуоресценции со временем. Это означает, что по мере роста плотности популяции синтезированный клетками аутоиндуктор накапливается и запускает экспрессию — механизм, который в промышленных условиях можно использовать для автоматического запуска продукции белка при достижении определенной плотности культуры. В системе с делецией luxI флуоресценция без добавления индуктора оставалась на фоновом уровне, обеспечивая жесткий контроль и возможность более точного управления синтезом целевого белка за счет добавления индуктора в различных концентрациях.
Индукция происходит только при пониженной температуре 22°C, а при повышении до 37°C синтез белка практически полностью прекращается. Это свойство было использовано для создания метода фиксации промежуточного содержания целевого белка. Способность фиксировать промежуточные уровни экспрессии при переключении температуры позволяет проводить эксперименты, где количество белка должно быть строго дозировано, что особенно важно для изучения токсичных белков или взаимодействий внутри клетки.
Работа дает фундаментальное понимание того, как клеточная популяция обрабатывает и распределяет сигнал. Разработанная система представляет собой модельную платформу для изучения этих процессов в контролируемых условиях и является эффективным инструментом в биотехнологии бактерий. Это важный шаг в создании технологий точной регуляции генной экспрессии.
Научная статья: Ekaterina Scheglova, Sabina Nebieva, Kamilla Mekhantseva, Siarhei Bukhalovich, Anna Kudryavtseva, Nikolay Bondarev, Nikolay Ilyinsky, Sergey Bazhenov and Ilya Manukhov. Psychophilic Quorum Sensing Genes Enable Unimodal, Adjustable Protein Expression Across the Entire Escherichia coli Population // Biotech, 2026; DOI: https://doi.org/10.3390/biotech15030057.
Работа выполнена при поддержке госзадания №075-03-2026-305 (FSMG-2025-0003) и РНФ №22-14-00124-П.
