Биофизики из Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ с коллегами из Европы и Японии определили молекулярный механизм, с помощью которого ионы кальция блокируют вирусные канальные родопсины. Они впервые получили структуры белка OLPVR1 сверхвысокого разрешения, позволившие увидеть, где именно кальций «застревает», не давая каналу перестроиться в открытое положение. Эти данные проясняют базовые механизмы работы вирусных канальных родопсинов и открывают путь к созданию новых оптогенетических инструментов. Работа опубликована в журнале Nature Communications. Исследование поддержано Министерством науки и высшего образования РФ (соглашения №075-03-2024-117, №075-15-2025-512 и №075-03-2026-305).
Канальные родопсины — это светочувствительные белки-каналы, которые открываются под действием света и пропускают ионы через клеточную мембрану. Их используют в оптогенетике — методе, позволяющем управлять активностью нейронов или других клеток с помощью световых импульсов. Эта технология произвела революцию в нейробиологии, дав исследователям беспрецедентный инструмент для изучения работы мозга и нервных цепей с помощью света, а 5 октября 2026 года ее разработчики были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине.
Классический инструмент оптогенетики — канальный родопсин 2 из водорослей — обладает серьезным недостатком: он крайне сложно кристаллизуется. В своей работе, опубликованной в 2017 году в журнале Science, ученые из Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ с коллегами из других стран первыми в мире определили его структуру, добившись хорошего качества кристаллов. Отсутствие достаточного числа кристаллов канального родопсина 2 не позволило в 2017 году определить механизм открытия канала и пути транспорта ионов, что затрудняло дальнейшее развитие оптогенетики. Тогда исследователи приняли неординарное решение: переключиться на изучение более «удобного» вирусного гомолога.
«У нашего успеха — получения структур канального родопсина высокого разрешения, есть несколько составляющих,— комментирует Сергей Бухдрукер, научный сотрудник Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ и первый автор работы.— Первая — техника, или наш „фотоаппарат“, с помощью которого мы фотографируем канал в процессе его работы. В 2020 году европейский синхротрон ESRF, где мы проводили исследования, был существенно модернизирован: электронный пучок удалось сделать значительно более компактным и стабильным, благодаря чему яркость рентгеновского излучения выросла примерно в 100 раз. Это позволило получать более сильный дифракционный сигнал, в том числе от очень небольших кристаллов.
Вторая — идея нашего руководителя Валентина Ивановича Горделия сменить объект исследования. С канальным родопсином 2 мы уперлись в потолок возможностей, получив кристаллы с разрешением 2,4 ангстрема. Это разрешение хорошее, но недостаточное, чтобы „увидеть“, например, расположение отдельных ионов внутри или снаружи канала. И более того, чтобы получить эти кристаллы, пришлось потратить много лет работы и перебрать сотни образцов, прежде чем один из них дал хорошую дифракционную картину. Поэтому сейчас есть только одна структура канального родопсина 2 — наша. Другие группы исследователей, увидев наши результаты, просто свернули все свои наработки в этом направлении, потому что улучшить эти данные с текущим развитием технологий не представляется возможным. В связи с этим было принято решение перейти на гомологи канального родопсина 2».
Перебрав немало вариантов, исследователи нашли исключительно удачный гомолог (белок из другого организма, схожий по аминокислотной последовательности) из семейства вирусных канальных родопсинов (VCR1). Это белки гигантских вирусов, заражающих одноклеточные водоросли и другие микроорганизмы. Зачем они самому вирусу, до конца не ясно. Но один из них — OLPVR1 — оказался удобной моделью: он хорошо производится в бактериях и образует высокоупорядоченные кристаллы.
Кроме того, OLPVR1 обладает необычным свойством: помимо ионов натрия и калия, стандартных для катионных канал родопсинов, он способен проводить ионы кальция, однако при этом его активность подавляется высокими (мМ) концентрациями кальция. Такая «дуальность» канала дает возможность, с одной стороны, детально изучить путь переноса кальция внутри канала, а с другой — понять механизм блокировки канала. Исследователи из МФТИ и их коллеги решили разобраться в механизме переноса кальция и кальциевой блокады на атомарном уровне.
Еще один фактор, обеспечивший успех исследователей,— подход, который применялся для изучения кальциевого механизма. Кристаллы, которые дают данные наиболее высокого разрешения, росли в кристаллизационных буферах, в которых источником ионов является поваренная соль, NaCl. Чтобы изучить работу канала OLPVR1 в присутствии кальция, было решено вымачивать готовые кристаллы в CaCl2.
«Чтобы не ухудшить качество кристаллов, мы прибегли к уловке,— рассказывает Сергей Бухдрукер.— Мы не стали менять прекрасно работающий протокол по выращиванию кристаллов и по-прежнему растили их в буфере с NaCl, вместо того чтобы долго и сложно отимизировать их рост в присутствии катионов кальция. Потом мы „вымачивали“ кристаллы OLPVR1 в растворах хлорида кальция и бария, что помогло сохранить хороший дифракционный сигнал. Это помогло нам увидеть движение и накопление Ca2+ и Ba2+ внутри канала».
Высокое разрешение — до 1,4 Å — позволило увидеть отдельные ионы внутри и снаружи белка. Оказалось, что кальций может занимать два разных положения. На поверхности белка он связывается между спиралями TM4 и TM5 — это, вероятно, «вход» для двухвалентных ионов со стороны цитоплазмы. Это предположение подтвердили с помощью вымачивания OLPVR1 с другим двухвалентным ионом, барием. Ba2+ садится в тот же сайт, что и Ca2+, но за счет большей тяжести дает в несколько раз более сильный и удобный для измерения сигнал. Внутри же канала кальций координируется остатками треонина T87 и T88, а также карбонильным кислородом метионина M84. Именно это внутреннее связывание оказалось ключевым для блокады.
Чтобы увидеть, что происходит при активации светом заблокированного кальцием канала, ученые применили метод криозахвата. Кристаллы OLPVR1, «вымоченные» с хлоридом кальция, сперва освещали лазером с длиной волны 532 нм для активации канала, а затем быстро замораживали криоструей при температуре 100 К, при которой движение молекул полностью замораживается. Так удалось зафиксировать белок в состоянии, когда канал должен был открыться, но не смог.
В кальций-блокированном состоянии канал действительно не открывается полностью. Один из аминокислотных остатков, E44, не поворачивается так, как это происходит при нормальном открытии. Рядом с атомом кислорода в белковой цепи возле остатка лизина K204, который удерживает светочувствительную молекулу ретиналь, застревает лишний ион натрия. Кальций, сидящий внутри канала, не пускает натрий дальше и одновременно держит «затвор» закрытым.
Спектроскопия подтвердила эту картину. Инфракрасные спектры показали, что кальций прикрепляется к белку под действием света. При этом у самого белка меняется протонированное состояние ключевых глютаматов (E44 и E51): в норме они удерживают ионы водорода, но при активации E44 свой протон отдает — становится отрицательно заряженным, и это помогает ему повернуться и открыть канал; кальций этому повороту не дает произойти. Немного меняется и форма одной из спиралей.
Методы времяразрешенной спектроскопии, которые следят за быстрыми изменениями после вспышки света, показали, что кальций растягивает фотоцикл — последовательность состояний, через которые белок проходит после поглощения света. Поздние промежуточные стадии этого цикла становятся длиннее и заметнее. Это полностью соответствует атомарной картине — ионы кальция как будто замораживают канал, удерживая его в приоткрытом состоянии.
«Главный акцент этой работы — впервые удалось получить структуры высокого разрешения с ионами кальция, бария и натрия, связанными с канальным родопсином,— подытожил Сергей Бухдрукер.— Эти данные позволяют понять, какие участки канала ионы проходят, чтобы перейти из внеклеточного пространства внутрь клетки или обратно. Зная путь, мы можем модифицировать белок и создать улучшенный инструмент для оптогенетики, который, например, специфически пропускает кальций или, наоборот, не пропускает его».
«В недавней работе было показано, что OLPVR1 вызывает светозависимый выброс кальция из ЭПР в клетках млекопитающих,— дополнил Всеволод Сударев, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной клеточной биологии и оптогенетики МФТИ.— Такое поведение является уникальным среди родопсинов. Управление клеточным кальцием открывает большие возможности для влияния на жизнедеятельность клетки; при правильной частоте кальциевых выбросов можно заставлять клетку делиться или умирать.
В частности, в той же работе было показано, что с помощью OLPVR1 можно управлять движениями животных (головастиков). Концентрация кальция регулирует многие процессы в нашем организме, например, сокращение мышц, работу сердца, формирование памяти и передачу нервного импульса. Потенциально, многие их этих процессов в будущем можно будет контролировать с помощью OLPVR1!».
Полученные данные открывают путь к рациональному дизайну оптогенетических инструментов. Зная точный путь ионов и места, где кальций «застревает», можно методом рационального мутагенезиса направленно менять аминокислотные остатки, чтобы канал либо избирательно пропускал кальций, либо, например, становился нечувствительным к его блокирующему действию. Такие генно-модифицированные каналы будут применятся для лечения заболеваний, особенно связанных с нарушениями в системе передачи сигналов внутри клетки, где роль посредника выполняют ионы кальция. Сбои в этой тонкой системе связаны с широким кругом заболеваний. К ним относятся болезни сердца, шизофрения, биполярное расстройство, болезнь Альцгеймера, а также мигрень, эпилепсия, диабет и некоторые виды рака.
Научная статья: Dmitrii Zabelskii, Sergey Bukhdruker, Gerrit H. U. Lamm, Siarhei Bukhalovich, Mako Aoyama, Vsevolod Sudarev, Alexander Kuzmin, Mikihiro Shibata, Kota Katayama, Hideki Kandori, Josef Wachtveitl, Ernst Bamberg & Valentin Gordeliy. Molecular mechanism of calcium inhibition in viral channelrhodopsins // Nature Communications (2026)17:9875. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-026-77716-5
Кроме сотрудников Московского физико-технического института, Исследовательского центра Юлиха (Германия) и Института структурной биологии (Гренобль, Франция) в работе принимали участие их коллеги из Института технологии Нагои (Япония), Киотского университета (Япония), Франкфуртского университета имени Гете (Германия), Европейской молекулярно-биологической лаборатории (EMBL, Гамбург, Германия), Европейского синхротронного центра (ESRF, Гренобль, Франция) и других научных центров.
