Задача: исправить поломанный ген в бесчисленных клетках, разбросанных по всему телу. Причем желательно, не затронув клетки другого типа, не промахнувшись по ДНК и не попав в поле внимания иммунной системы. Лучшим решением оказались вирусы, которые раньше были для медиков только источником проблем. Рассказываем о том, какие вирусы и как можно использовать для генной терапии, в чем их недостатки и есть ли альтернатива.
Как устроен вектор
Вирус вне клетки — это вирион (вирусная частица), минималистичная и инертная «заготовка». Он выглядит как упаковка из белка в виде икосаэдра (многогранник с 20 гранями) или цилиндра, внутри спрятан геном: ДНК или РНК. Иногда снаружи также имеется мембрана из липидов и белков, «похищенная» у клетки, из которой этот вирион отпочковался.
Задача вириона — доставить содержимое в конкретные клетки. За это отвечают белки на поверхности, которые специфично связываются с рецепторами, характерными для этого типа клеток. Попадая внутрь, вирус тем или иным способом «раздевается» и в цитоплазме оказывается его геном. Некоторые вирусы идут дальше и проникают внутрь ядра. Там они могут оставаться в форме отдельных молекул ДНК или прицельно встраиваться в определенные участки хозяйской ДНК. Такое вторжение в геном может закончиться мутацией и даже толкнуть клетку на путь злокачественного перерождения — превращения в опухолевую. За подобным ученые застали множество вирусов: вызывающий бородавки папилломавирус, вирусы гепатита B и C и другие.
Но кроме онкогенных, существует множество более безобидных вирусов, какие предпочесть? Хороший вирусный вектор, то есть средство для направленной доставки, должен:
- быть достаточно большим, чтобы в него уместился человеческий ген,
- эффективно изменять геном целевой клетки,
- не встраиваться в важные участки генома,
- не быть слишком заметным для иммунитета.
Разумеется, для превращения вируса в вектор его необходимо сначала «обезоружить» — лишить генов, вызывающих заболевания и позволяющих ему копировать себя, иначе вместо терапии получится вирусная инфекция. Под эти критерии подходят разные группы вирусов, но некоторые оказались удобнее прочих. На их основе и создают большинство генотерапевтических препаратов.
Аденовирусные векторы
Аденовирусы заражают множество позвоночных животных, вызывая инфекции разной степени тяжести. Среди самых известных — возбудители ОРВИ. Аденовирусы привлекли внимание ученых еще на самых ранних этапах развития генной терапии. Их сильные стороны:
- солидные размеры (70–90 нанометров),
- крупный геном (34–43 тысяч пар оснований), куда хорошо влезают человеческие гены,
- способность инфицировать клетки с разной скоростью деления.
У аденовирусов нет мембраны, поэтому они причаливают напрямую к рецепторам на поверхности клеток. Далее рецептор вместе с вирионом попадает в мембранный пузырек и «тонет» в клетке. Упаковка из белков распадается, выпуская геном в виде двухцепочечной ДНК. Та попадает в ядро, но не встраивается в геном клетки, а остается в свободном плавании в виде эписомы. Тем не менее клеточные ферменты синтезируют на ней РНК.
Такие вирусы сначала сочли лучшими для лечения моногенных заболеваний — тех, что вызваны мутацией всего одного гена. Аденовирусные векторы пытались применять для лечения муковисцидоза, Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита (X-SCID), дефицита фермента альфа-1 антитрипсина и других болезней.
Первый опыт использования аденовирусных векторов был получен еще в 1990-х, однако вскоре выяснилось, что они слишком сильно активируют иммунную систему. Это не только мешало доставить нужный ген, но и угрожало здоровью людей. В 1999 году клинические испытания аденовирусного вектора для лечения генетического заболевания печени привели к смерти 18-летнего американца Джесси Гелсингера, что надолго затормозило развитие генотерапии. В итоге сейчас аденовирусные векторы используют главным образом для лечения онкологических болезней.
Векторы на основе аденоассоциированных вирусов
Аденоассоциированные вирусы (AAV) не родственники аденовирусов, а скорее их нахлебники, и впервые были выделены в качестве их примеси. AAV копируют себя лишь при помощи других, это может быть аденовирус или вирус простого герпеса. Поэтому у AAV немало полезных для генной терапии свойств:
- они просто устроены, у них маленькая частица (примерно 20 нанометров) и короткая ДНК (около 4,7 тысячи пар оснований), с которыми удобно работать,
- несмотря на простоту, они обеспечивают длительную стабильную экспрессию генов,
- они не вызывают у человека болезней, слабо влияют на иммунную систему и потому безопаснее других.
AAV считают лучшим вектором для долговременного изменения активности генов.
По меньшей мере 13 природных разновидностей AAV предложили использовать для генной терапии, а восемь препаратов на их основе уже одобрены к применению. Среди них был и «Глибера», первый генотерапевтический препарат в Европе, а сейчас это, например, «Золгенсма» от спинальной мышечной атрофии и «Отармени» — совсем недавно одобренная терапия от одного из видов врожденной глухоты.
Есть у AAV и недостатки: слишком большие гены просто не умещаются в крошечные векторы. Кроме того, люди часто встречаются с вирусами этой группы и у многих есть к ним антитела, из-за чего вектор быстро нейтрализуется в крови. Также иногда генотерапия AAV все-таки вызывает повреждения печени и почек, а в редких случаях — активирует иммунитет.
Лентивирусные векторы
В отличие от аденовирусов и AAV, геном лентивирусов представлен не ДНК, а одноцепочечной РНК. Она имеет длину до 9 тысяч пар оснований и упакована в вирион размером около 100 нанометров, снаружи к тому же имеется мембранная оболочка. Это представители группы ретровирусов, поэтому они переписывают свою РНК в ДНК с помощью специальных ферментов — ревертаз. Далее эта ДНК переносится в ядро и встраивается в клеточный геном, тем самым обеспечивая долговременную экспрессию и передачу внесенного гена по наследству новым клеткам.
У лентивирусных векторов есть важный плюс: они подходят как для активно делящихся клеток, так и для почти прекративших деление, вроде мышечных или нервных клеток. Поэтому их используют для лечения некоторых нейродегенеративных болезней, имеющих генетическую природу. Однако слабые стороны лентивирусов как средства доставки напрямую растут из сильной. Надежная экспрессия гена после его встраивания в геном может обернуться мутациями, как следствие — злокачественным перерождением клеток. Поэтому лентивирусы часто применяют для терапии ex vivo: при этом подходе клетки извлекают из тела пациента, модифицируют и возвращают. По такому принципу работает терапия иммунодефицитов и других болезней крови, а также противоопухолевая терапия с помощью модифицированных Т-клеток — CAR-T.
На перечисленные три типа вирусных векторов приходится львиная доля методов генной терапии. Однако иногда ее создают и на основе других: ретровирусов, вируса простого герпеса (HSV), вируса везикулярного стоматита (VSV), модифицированного варианта вируса коровьей оспы Ankara (MVA), аренавирусов, вируса кори и прочих. О них вспоминают, когда нужны уникальные свойства того или иного вируса. Например, VSV используют для создания лекарств от рака печени, что связано с его способностью разрушать опухоли.
Невирусные средства доставки
В арсенал генной терапии сейчас входят и другие носители — совсем не биологические векторы. Такие искусственные емкости для генов получают за счет физических процессов и химических реакций. Соответственно, векторы-наночастицы лишены недостатков, характерных для вирусных векторов.
- Они не способны создавать свои копии и вызывать инфекции. Они также не провоцируют острую реакцию иммунитета, поскольку тот не видит в них врага. Отсюда главное преимущество — высокий уровень безопасности.
- Емкость наночастиц не настолько ограничена, как тесный вирион. Размер векторов можно менять, чтобы разместить в них даже самые крупные гены.
- Внутри наночастиц может находиться не только ДНК. Они могут нести в себе матричную РНК (мРНК) и инструменты для настройки экспрессии генов: регуляторные РНК, антисмысловые олигонуклеотиды и систему генного редактирования CRISPR/Cas9.
Список основ для невирусных векторов велик и постоянно расширяется. Наночастицы-векторы получают из липидов (жироподобных веществ), в том числе в смеси с белками (протеолипиды), из пузырьков-экзосом, выделяемых клетками, разных синтетических полимеров и неорганических носителей. Успешнее всего липидные наночастицы. Внутри них, как правило, четыре компонента: основная жидкость, катионная жидкость (ее ионы связывают отрицательно заряженную ДНК), полиэтиленгликоль (для стабильности) и холестерин — он делает липидную мембрану более устойчивой. Изменяя соотношения между ними, можно регулировать текучесть содержимого и эффективность доставки.
Среди полимерных векторов стоит отметить дендримеры — крупные молекулы, которые многократно ветвятся и могут нести на своих ветвях разные полезные грузы. Для генной терапии особенно перспективны дендримеры из полиамидоамина (PAMAM) — благодаря высокой симметрии и обилию мелких «веточек».
В роли векторов используют и неорганические вещества, например наночастицы золота. Оно химически инертно, поэтому не вступает в ненужные реакции с молекулами крови и содержимым клеток. К золотым векторам можно прочно «пришить» ДНК или РНК, а также другие вещества, нужные для внутриклеточной навигации, и даже систему генного редактирования CRISPR/Cas9.
Однако синтетические частицы лишены и преимуществ, характерных для вирусных векторов. Например, они малоэффективны и неточны: в организме наночастицы зачастую накапливаются в печени, которая стремится от них избавиться (при этом и печень сама страдает, и терапия не работает). К тому же невирусные векторы легко разрушаются под действием окружающей среды и требуют особых условий хранения и транспортировки.
Вызовы и точки роста
Главная проблема, которая стоит перед создателями генотерапевтических препаратов, — безопасность. В идеале организм должен как можно меньше реагировать на векторы, ведь иммунная система может не только нейтрализовать препарат, но и нанести серьезный вред здоровью пациента. Кроме того, векторы должны быть нетоксичны, то есть не вызывать повреждения и гибель клеток. А пока они несовершенны, приходится или подавлять иммунитет пациента, или менять способ введения препарата: вместо системного обходиться локальным — сделать инъекцию в нужный орган или ткань.
В будущем хорошо бы научиться совмещать сильные стороны вирусных и невирусных векторов — эффективность первых и безопасность с вместительностью вторых. А также и тем, и другим необходимо увеличить специфичность, это поможет снизить токсический эффект лечения и избежать вмешательств в геном случайных клеток, которым не «прописана» генная терапия.
