Коллаборация физиков и биологов научила наночастицы «видеть» митохондрии, энергетические фабрики клетки, с помощью гигантского комбинационного рассеяния. Воспроизводимый и чувствительный подход поможет в разработке сенсоров для диагностики заболеваний на ранних стадиях. Работа опубликована в журнале Free Radical Biology and Medicine.
Сбои в работе митохондрий могут стать причиной большого количества патологий. Например, нарушений работы нервной и сердечно-сосудистой систем, метаболических и онкологических заболеваний. На это тему проведено очень много исследований. Но до сих пор не было точного метода, позволяющего «отсканировать» работу интактных митохондрий, не существовало способа понять, правильно ли идет перенос электронов и как состояние отдельных переносчиков электронов связано с производством клеточной энергии и запуском патологий.
С помощью спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР, или SERS — surface-enhanced Raman spectroscopy)* можно получать информацию о структуре отдельных молекул, нанесенных на подложку из наночастиц. Но для использования этого метода в биомедицинской диагностике важно научиться получать интенсивный сигнал от молекул или групп молекул, находящихся внутри интактных органелл или клеток. Митохондрии — сравнительно большие объекты для этого способа исследования, около 1–2 мкм в диаметре. Глубоко к ним внутрь заглянуть не удавалось. К тому же для медицинской диагностики очень важно получать воспроизводимые от эксперимента к эксперименту спектры ГКР, чего раньше тоже не демонстрировали.
Цитохром С** — белок, который переносит электроны между комплексами дыхательной цепи митохондрий, необходимой для синтеза АТФ (внутриклеточной энергии), — популярный объект исследования. Если научиться «следить» за цитохромом С внутри митохондрий, можно будет диагностировать правильность работы всей дыхательной цепи.
Группа исследователей под руководством Надежды Браже из МГУ совместно с коллегами из МФТИ разработала новый подход на основе метода ГКР для изучения цитохрома С в митохондриях. Ученые заметили, что при определенной конфигурации подложки из серебряных наночастиц от цитохрома С, находящегося внутри митохондрий, можно получить высокоинтенсивный сигнал ГКР. Так они смогли увидеть белок-переносчик электронов внутри митохондрий.
Сергей Новиков, старший научный сотрудник лаборатории контролируемых оптических наноструктур МФТИ, рассказывает: «Гигантское комбинационное рассеяние имеет максимальный сигнал, когда наночастицы контактируют с молекулами. Чем дальше находится молекула от частицы, тем сигнал слабее. Интересующий нас белок цитохром С находится в межмембранном пространстве митохондрий, на расстоянии 7–12 нанометров от внешней мембраны. На обычной плоской серебряной подложке мы можем видеть ГКР-сигнал, в основном от компонентов внешней митохондриальной мембраны. В случае специфической конфигурации серебрянной наноструктурированной поверхности, разработанной коллегами с ФНМ МГУ и предложенной в нашей работе, мы смогли увидеть, что происходит с цитохромом С в межмембранном пространстве митохондрий. За счет высокой чувствительности метода мы видим изменения, которые произошли только в небольшом количестве белков цитохрома С. Эти изменения связаны с зарождающейся патологией. То есть, когда клетка в целом еще здоровая, мы можем отследить зарождение патологии на ранней стадии по изменениям в этих белках».
Ученые постепенно усложняли исследуемый объект от модельных до реальных митохондрий. Анализировался сигнал SERS от этих объектов, нанесенных на подложку c наночастицами серебра. С помощью сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии*** и теоретического моделирования физикам удалось построить распределение электрических полей для подложки с исследуемым объектом и объяснить, почему усиливается сигнал именно от цитохрома С: в полученной конфигурации подложки и объекта белок оказывается в «зоне видимости» SERS.
На рисунке изображена схема эксперимента: исследуемый объект помещается на подложку из серебряных наноструктур и освещается лазером. Для анализа используются регистрируемые спектры ГКР. Исследуемый объект усложняется от липосом — везикул, состоящих из липидной мембраны с адсорбированными на внутреннюю поверхность молекулами цитохрома С (а), до субмитохондриальных частиц («вывернутых наизнанку» митохондрий (б) и интактных митохондрий (с); (д) — схематическое изображение поля от лазера, усиливаемого подложкой из наноструктур так, что оно «достает» до молекул цитохрома С внутри липосомы. Источник: Free Radical Biology and Medicine
«Нужно было проверить, что митохондрии не изменяют свое состояние, когда контактируют с серебряными структурами, что серебряные структуры не изменяют своих свойств, что получаемый сигнал ГКР обладает высокой воспроизводимостью. Надо было на разных системах доказать, что спектр ГКР, регистрируемый от митохондрий, связан с определенными колебаниями атомов именно в цитохроме С, а не в других белках митохондрий, и показать, что наблюдаемые спектры отражают работу дыхательной цепи. У нас это все получилось », — комментирует Надежда Браже, ведущий научный сотрудник лаборатории общей биофизики МГУ.
В результате ученые получили метод наблюдения за белками внутри клеток, который может стать основой для создания сенсоров для диагностики заболеваний на ранних стадиях.
Исследование выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (договор № 075-15-2021-606 ), РНФ (гранты 21-72-10163, 21-74-00026, 20-73-00257) и РФФИ (20-04-01011).
*КР — это явление рассеяния света на молекулах вещества, при котором возникают новые световые волны с частотами, которые связаны с молекулярным строением вещества. Это используется для анализа химического состава и структуры материалов.
*Гигантское комбинационное рассеяние (ГКР, в английском Surface-enhanced Raman Spectroscopy, SERS ) — это эффект, при котором наночастицы благородных металлов с характерными размерами 50–100 нм многократно усиливают сигнал КР за счет возбуждения локализованных поверхностных плазмонов.
**Цитохром С — это белок, который содержит железо и переносит электроны между белками, участвующими в процессе создания внутриклеточной энергии. Также цитохром С, выходя из митохондрий, может запускать программу клеточной гибели — апоптоз.
***Сканирующая электронная микроскопия (SEM) и просвечивающая электронная микроскопия используются для построения изображения поверхностей материалов на нанометровом масштабе с высоким разрешением. SEM создает изображение, детектируя отраженные электроны, а TEM — электроны, которые проходят через образец.
